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ImmunoChem/PKA Kinase Assay Kits, Type II/96 Assays/Kit/ICP0217
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PKA Kinase Assay Kits, Type II
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DESCRIPTION
Protein kinase A (PKA) is a family ofenzymes whose activity is dependent on cellular levels ofcyclic AMP (cAMP). PKA is also known ascAMP-dependent protein kinase. Protein kinase A has several functions in the cell, including regulation ofglycogen,sugar, andlipidmetabolism. The kinase assay kit (Type II) is a non-radioactive, homogenous, simple, immunoblot type assay. It is designed for kinase solid affinity matrices such as IP kinases or PKAs on GSH beads. It is also useful for the activity analysis of PKA in the solution phase. The principle of the assay is that the PKA kinase phosphorylate the substrate-BSA conjugates (component C) in the presence of ATP. The phosphorylated BSA-substrate is then analyzed using SDS-PAGE resolution and immunoblotting technique.
QUALITY CONTROL
The kits were tested using recombinant PKA.Sensitivity is approximately 5 ng of active /assay in an un-optimized condition.
Assay for activity of kinase using the type II kit (ICP0217)
A,100 ng; B, 50 ng; C,25 ng; D,12 ng; E, 6 ng; F, 0.00 ng
STORAGE AND STABILITY:
The kit is stable for 6 months at 4oC from date of shipment.
KIT COMPONENTS
A.Rabbit anti-phosphoSubstrate (anti-pSubstrate): 250 µg/mL in 200 µL of Tris acetate buffer, affinitypurified rabbit polyclonal, anti-phosphopeptide substrate (pCrebtide) antibodies (catalog# ICP0180). The anti-pSubstrate antibodies specifically recognize the phosphorylated form of the substrate but not the non-phosphorylated form. Dilute the antibody to 0.25-0.5 µg/mL with antibody dilution buffer (B) for working solution (enough to prepare 100 mL of working antibody solution).
B.10 x Antibody Dilution Buffer (AbDB): Catalog# ICP0217b, 2x10 mL. Dilute 10 mL of AbDB to 100 mL with distilled water asworking buffer solution
C.BSA-Substrate Conjugates (BSA-Sub): Catalog# ICP0217c, 250 mg/mL in 500 µL kinase assay dilutionbuffer (D). Approximately 10 molecules of kinase substrate peptide (RPRAATF-NH2) were conjugated to one molecule of BSA. Apparent molecular weight of the major conjugate is 70-80 kDa. The apparent MW for the aggregated form is approximately 150 kDa (enough for more than 100 assays).
D.Kinase Assay Dilution Buffer (ADB): Catalog# ICP0217d, 10 mL. 20 mM MOPS, pH7; 25 mM beta-Glycerolphosphate; 1 mM EGTA; 1 mM sodium orthovanadate; 1 mM DTT; and 2 mM MgCL.
E.Adenosine Triphosphate (ATP): Catalog# ICP0217e, 2x2 mg, Dissolve in 2 mL kinase assay dilution buffer (D) as working solution. Aliquot as 100 mL/vial and store at -20oC if not used all at once.
Additional Reagents Required but not Supplied:
1. Anti-rabbit Ig"s secondary antibodies.
2. PBSt washing buffer
3. 3% BSA or 3% skimmed milk as blocking buffer
4. All reagents and materials for SDS-PAGE, transfer materials, and signal generating system (such as BCIP/NBT or ECL)
PROTOCOL
Stage One: Preparation of kinase
1. Preparation of Kinase in Solution: Prepare the purified or partially purified (fractionated) kinase in 10 µL of the kinase assay dilution buffer (component D) with the required concentration in microcentrifuge tubes. For inhibitor screening, serial dilutions (range from 1000 to 50 ng/assay) of kinase should be tested for the optimal working concentration.
2. Preparation of the Immunoprecipitated Kinase:
Incubate anti-PKA (able to IP native kinase), or anti-tag (for tag-kinase) with 10 to 20 µL of protein A for 1 hr. Then wash away any unbound antibodies. Incubate the cell lysate sample in 250 µL of lysate buffer with the antibody-protein A complex in a rotor shaker at 4oC for 2 hrs. The user should select their own cell lysate buffer that contains protease and phosphatase inhibitors. The cell lysate sample should contain >20 ng of active PKA. Centrifuge and aspirate with PBSt twice then with kinase assay dilution buffer (D) twice. After aspiration, re-constitute the immunoprecipitated matrix in 10 µL of kinase assay dilution buffer (D).
3. Preparation of Kinase Purified with Affinity Matrix (GSH, Ni, maltose, etc.): The user should purify therecombinant kinases, such as PKA, following their own protocol. 10-20 µL of affinity matrix/assay is recommended. Do a final wash and aspiration of the matrix with kinase assay dilution buffer (D) then re-constitute the aspired matrix with 10 µL of the kinase assay dilution buffer.
Stage Two: PKA kinase activity assay
1. Add 2.5-5 µL of the BSA-kinase substrate (component C) to the kinase sample prepared in stage one.
2. Add 5 µL of the ATP (component E) solution to initiate the kinase reaction. Incubate at 37oC for 60 min with constant shaking or hand shake every 5 min.
3. Stop the kinase reaction with 20 µL of SDS-sample loading buffer and boil for 2 min.
Stage Three: Running SDS-PAGE and transfer;
1. Prepare a 8% SDS-acryamide gel.
2. Run the SDS-PAGE until the dye-front is approximately 2-3 cm past entering the separation gel.
3. Perform the normal gel transfer to a nitrocellulose membrane. The membrane only needs to cover between the top of separating gel and the distance to MW marker 60 kDa.
Stage Four: Immunoblotting.
1. Block the membrane with 3% BSA or 3% skimmed milk for 30-60 min
2. Wash the membrane twice with PBSt.
3. Incubate with 10 mL of anti-pSubstrate (component A), 0.25-0.5 µg/mL in antibody dilution buffer (component B) at room temperature for 2-4 hours, or 4oC overnight.
4. Wash the membrane with PBSt 4 times at 5 min intervals.
5. Incubate with anti-rabbit IgG secondary antibodies for 1-2 hours.
6. The user should select their own method (either colormetric or ECL system) for the signal generation
Summary of the Assay:
1.Kinase reaction: BSA-KRREILSRRPSYR + ATP + Kinase -> BSA-RREILSRRPpSYR
2.SDS-PAGE resolution and transfer
3. Specific immunoblotting for detection of the kinase product BSA-KRREILSRRPpSYR probed with anti-pSubstrate antibody
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2021-09-06
北京雷根生物技术有限公司在发布的甲醛凝胶加样缓冲液(10×,RNase free)供应信息，浏览与甲醛凝胶加样缓冲液(10×,RNase free)相关的产品或在搜索更多与甲醛凝胶加样缓冲液(10×,RNase free)相关的内容。 查看更多
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2017-09-28
缓冲溶液指的是由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定。... 查看更多
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2021-09-05
杭州吉诺生物医药技术有限公司在发布的PBS缓冲液 PH7.3-7.5供应信息，浏览与PBS缓冲液 PH7.3-7.5相关的产品或在搜索更多与PBS缓冲液 PH7.3-7.5相关的内容。 查看更多
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2017-08-03
上海羽朵生物科技有限公司在发布的HRP反应终止缓冲液供应信息，浏览与HRP反应终止缓冲液相关的产品或在搜索更多与HRP反应终止缓冲液相关的内容。 查看更多
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2017-08-25
广州威佳科技有限公司在发布的MOPS缓冲液（RNaseA free）（1×）供应信息，浏览与MOPS缓冲液（RNaseA free）（1×）相关的产品或在搜索更多与MOPS缓冲液（RNaseA free）（1×）相关的内容。 查看更多
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2021-07-28
乙醇－醋酸铵缓冲液（pH3.7） 取5mol/L醋酸溶液15.0ml，加乙醇60ml和水20ml，用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000ml，即得。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.0） 取三羟甲基氨基甲烷12.14g，加水800ml，搅拌溶解，并稀释至1000ml，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0，即得。 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH8.1） 取氯化钙0.294g，加0.2mol/L三羟甲基... 查看更多
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2021-07-21
loading buffer 的中文名字叫上样缓冲液,6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的紫兰色的条带是溴酚蓝，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同；后面的兰色条带是二甲苯青，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双... 查看更多
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2017-03-28
10X Taq 缓冲液（含(NH4)2SO4、20mM MgCl2）是由上海沪震实业有限公司代理或销售的HZbscience品牌的试剂，产品来源于中国/上海。上海沪震实业有限公司是中国最权威的10X Taq 缓冲液（含(NH4)2SO4、20mM MgCl2）试剂销售服务商之一，在中国-上海等地方销售10X Taq 缓冲液（含(NH4)2SO4、20mM MgCl2）试剂已经多年。生物在线为您提供众多企业10X Taq 缓冲液（含(NH4)2SO4、20mM MgCl2）仪器产品及图片，以便挑选到性价比高 查看更多
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2017-03-21
苏州艾莱萨生物科技有限公司在发布的10×电泳转移缓冲液（转膜液）供应信息，浏览与10×电泳转移缓冲液（转膜液）相关的产品或在搜索更多与10×电泳转移缓冲液（转膜液）相关的内容。 查看更多
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2017-09-10
www.biozj.com 查看更多
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2021-08-10
规格（核心参数）：125ml/瓶；PH6.86；是PH计/酸度计上面用的试剂，也叫标准缓冲溶液
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怎样配制0.1mol/LpH7.8磷酸盐缓冲液 123
然201401062017-04-20
选择缓冲溶液的原则是什么? 配制缓冲溶液时,如何选择合适的缓冲对?123
yexiaoyunima2017-10-03
选择缓冲溶液的原则：
1、 缓冲溶液对反应物的测定没有干扰
2、缓冲组分的浓度为1:1
3、有足够的缓冲容量
4、缓冲溶液的PH应在所需范围内
5、组成缓冲溶液的弱碱PKB和弱酸PKA应接近或等于所需的POH值或PH值（PH+POH=14）
配制
只要知道缓冲对的PH值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度），就能按公式计算[盐]和[酸]的量。这个算法涉及对数换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系并列出了表格。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算出所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。
经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升，而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。
计算好后，按计算结果准确称好固态化学成分，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，就能得到所需的缓冲液。
各种缓冲溶液的配制，均按表格按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确浓度才能进行，如醋酸、氢氧化钠等。另外，所有缓冲溶剂的配制计量都能从以上的算式准确获得。
1、 缓冲溶液对反应物的测定没有干扰
2、缓冲组分的浓度为1:1
3、有足够的缓冲容量
4、缓冲溶液的PH应在所需范围内
5、组成缓冲溶液的弱碱PKB和弱酸PKA应接近或等于所需的POH值或PH值（PH+POH=14）
配制
只要知道缓冲对的PH值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度），就能按公式计算[盐]和[酸]的量。这个算法涉及对数换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系并列出了表格。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算出所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。
经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升，而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。
计算好后，按计算结果准确称好固态化学成分，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，就能得到所需的缓冲液。
各种缓冲溶液的配制，均按表格按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确浓度才能进行，如醋酸、氢氧化钠等。另外，所有缓冲溶剂的配制计量都能从以上的算式准确获得。
凝胶过滤中的脱盐柱的使用123
山东圣奥LL2021-07-21
蛋白上样缓冲液详解123
zhanglijun1409212017-06-06
上海比恺姆化学有限公司123
llm10262017-02-06
4xLaemmli缓冲液10ml 1610747123
cindy葉2017-10-02
是sds-page实验用的
0.01mol/L(PH7.0)的磷酸盐缓冲液怎么配制,请详细说明,谢谢 123
zlq02132017-08-15
TBST缓冲液配制及使用方法 123
solarbio_2017-05-12
TBST中含有Tris-Hcl，NaCl，Tween20这三种物质，是做WESTERNBLOT中常用的一种缓冲液。
TBST缓冲液的配制
1000ml×TBST的配置
先称量NaCl40g，倒入烧杯中，加DDW蒸馏水400ml,再称量NaCl47.6g，倒入刚才的那个烧杯中（PS：由于NaCl的量太多，一次称量不方便，所以分两次称量，且易于溶解）。往烧杯中加入Tris—HCl缓冲液100ml，最后加（吐温20）5ml,转入1000ml容量瓶中，在定容，转移即可。
TBST缓冲液的应用：
1.主要用于免疫组化和原位杂交，酶联免疫等实验中，清洗免疫印。
2.迹膜；
注意事项：
1.TBST缓冲液，PH7.2-7.5；
2.颜色为无色透明液体；
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴防护手套操作；
病毒稀释液的PBS缓冲液_问答详情_蚂蚁淘,【正品极速】生物医学...123
dxy_vhyyq2y2021-07-23
跑电泳前,样品与上样缓冲液混匀时,颜色出现变化? 微生物...123
yilikouzi2017-07-24
磷酸化/去磷酸化对蛋白功能的影响竟有这么大?_研究123
cy64832892017-06-26
McIlvaine缓冲液 123
jop975642017-10-03
McIlvaine缓冲液属于广域缓冲溶液，pH调节范围在3～8之间，缓冲范围较大，可以用于多种用途，例如线粒体的分离染色等。Leagene的McIlvaine缓冲液(pH4.1)主要由磷酸氢二钠和柠檬酸组成，pH4.1，属于最常用的一种广域缓冲溶液。
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