Western_Blot常见问题解析
| 可能原因 | 建 议 |
| 1、抗体浓度太高 | 一抗或二抗浓度太高会导致高背景，降低抗体浓度 |
| 2、使用的封闭液不兼容 | 对比不同的封闭缓冲液 |
| 3、非特异性位点封闭不足 | 优化封闭缓冲液，最好的封闭缓冲液具有系统依赖性 |
| 提高封闭液中蛋白的浓度 | |
| 优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1h或者4°C封闭过夜 | |
| 在封闭液中加入Tween-20，Tween-20的终浓度为0.05% | |
| 4、封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 | 换一种不同的封闭液 |
| 不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素 | |
| 交叉反应的检测。封闭一张干净的膜，与抗体一起孵育，然后用超感应化学发光底物检测 | |
| 5、洗涤不充分，增加洗涤次数和使用缓冲液的体积 | 降低HRP结合物的浓度 |
| 如果洗涤液中无Tween-20，添加Tween-20使其终浓度为0.05% | |
| 6、膜的曝光时间过久 | 缩短印迹膜曝光到胶片的时间 |
| 按照说明书的指示，保证膜始终是湿润的 | |
| 用一张新膜 | |
| 保证膜完全被液体覆盖，避免其干燥 | |
| 在孵育过程中始终进行震荡 | |
| 小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合 | |
| 不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子 | |
| 7、缓冲液污染或结块沉淀 | 制备新的缓冲液 |
| 8、抗体浓度太高 | 若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景，降低抗体浓度 |
| 9、HRP处产生聚集体 | 用0.2μm过滤器过滤结合物 |
| 10、结合可产生斑点 | 用一种新的高质量的结合物 |
| 11、缓冲液中有污染 | 使用新的缓冲液 |
| 缓冲液使用前过滤 | |
| 12、操作设备被污染 | 保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物 |
| 保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景 |
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发布于 ： 2021-07-14
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