| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 单层培养的Sf9细胞待接种的杆状病毒（野生型的或重组） 试剂、试剂盒 | 含10％胎牛血清的昆虫细胞培养液TNM-FH 仪器、耗材 | 150mm培养瓶27℃培养箱倒置显微镜带有GH-3.7水平转子的4℃GPR离心机带螺口盖的冻存管液氮罐500ml旋转细胞培养瓶多转瓶的揽拌台 实验步骤 | 1.以1.8×107Sf9细胞/瓶的密度，将细胞接种于两个150mm培养瓶，在含10％胎牛血清的昆虫细胞培养液TNM-FH中培养。27℃温育1h使细胞贴壁。 2.当细胞贴壁时，取适量的待接种的杆状病毒于30ml新鲜的含10％胎牛血清的昆虫细胞培养液TNM-FH，使感染复数（MOI）为0.1～1。细胞贴壁后，移去培养液，每个培养瓶中各加入15ml含有病毒的培养液。 MOI以pfu/细胞来表示。感染给定数目细胞的病毒接种物的体积=MOI（pfu/细胞）×[细胞数/毒种储液的滴度（pfu/ml）] 3.27℃温育数日。每天在倒置显微镜下观察感染迹象，如细胞病变效应（如果使用包含体阴性重组病毒），或包含体（如果使用野生型杆状病毒或包含体阳性重组病毒）。包含体具高折光性，带微黄的绿色晶体状，在光学显微镜下很容易发现。 4.当大多数细胞含有包含体或显示出细胞病变效应时（通常在感染后4～5天），将培养液移入灭菌试管中，4℃，1000g离心10min，将上清移至一新的灭菌试管。分别吸取1ml上清移至几个螺口冻存管中，置于液氮罐长期保存。将剩余的病毒置暗处4℃短期保存。该步骤应可得到约40ml（1～3）×108pfu/ml的病毒储液。 注意事项 | 如果待扩增的病毒源自单个噬斑（见病毒储液滴度测定实验），将琼脂糖块置于一含0.5mlTNM-FH/10％FBS的小离心管中4℃旋转过夜。再按步骤1.1感染Sf9细胞：在100mm培养皿中，用2×106细胞，27℃温育1h。加入8mlTNM-FH/10％FBS培养液，27℃温育4天。按步骤1.4收获病毒。噬斑法确定滴度（见病毒储液滴度测定实验），重复步骤1.1～1.3，扩增病毒以获得高滴度的储液。如果昆虫细胞已适应无血清培养，病毒储液也可用无血清培养的昆虫细胞制备（见昆虫细胞保存培养实验）。用无血清培养液代替TNM-FH/10％FBS，按步骤1.1～1.4进行即可。 其他 | 展开 |
