| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 对数生长期单层培养的Sf9细胞 试剂、试剂盒 | 杆状病毒储液昆虫细胞培养液 仪器、耗材 | 琼脂糖顶层覆盖物台盼蓝顶层覆盖物（选用）60mm组织培养皿27℃培养箱1.5ml带螺口盖的冻存管 实验步骤 | 1.用含10％胎牛血清的TNM-FH培养液稀释处于对数生长期的Sf9细胞至约5×105细胞/ml。在噬斑试验之前几小时，以两种不同的密度（2×106和1.5×106细胞/ml）将细胞种于60mm组织培养皿中。对病毒储液的每一稀释度均设复皿（二个组织培养皿），27℃培养。 2.根据病毒储液的来源，用TNM-FH/10％FBS培养液制成5ml病毒储液的系列稀释液。 高滴度病毒储液：10-6、10-7、10-8稀释 转染上清（野生型病毒环状DNA）：10-4、10-5和10-6稀释 转染上清（野生型病毒线性化DNA）:10-1和10-2稀释 单个噬斑：10-1、10-2和10-3稀释 3.用一根灭菌巴斯德吸管小心从细胞（步骤1）中吸去培养液。每一稀释度的病毒均加1ml至各复皿中27℃温育1h，加入病毒时摇动培养皿以保证病毒能均匀感染细胞。 4.温育1h后，制备琼脂糖顶层覆盖物。 5.用一根灭菌巴斯德吸管吸去病毒上清液，加入4ml琼脂糖覆盖物。让琼脂糖室温固化10～20min(让凝结的水滴散去）。用Parafilm膜分别封住每个平皿（以防干涸），27℃培养6～8天。 6.在噬斑形成较好而且裸眼容易看出的培养皿上，计数每一稀释度形成的噬斑数，计算病毒滴度（pfu/ml）。在10-7稀释度的培养皿形成10个噬斑或在10-8稀释度的培养皿形成1个噬斑，病毒滴度计算为108pfu/ml。 7.如果裸眼辨别噬斑时遇到困难，则用台盼蓝染色。制备台盼蓝覆盖物，倾覆1ml至培养了6～8天噬斑形成较好的培养皿中。27℃过夜温育培养皿，让染料扩散进入死细胞，计数蓝色噬斑的数目并确定病毒滴度。（噬斑内的死细胞将吸收台盼蓝染料，噬斑周围的活细胞不会吸收台盼蓝染料。） 确定病毒滴度的另一方案是终点稀释法。采用这种方法，需制备一系列病毒稀释液，并以此感染微量滴定板中的细胞，然后记好每一孔是否存在病毒感染并确定50％终点。然而用这种方法滴定重组病毒储液，得到的结果与噬斑试验相比较难解释。野生型病毒由于包含体的聚集很容易计数，而重组病毒则由于没有包含体有时难以计数。 注意事项 | 1.每一稀释度均设复皿是必需的，因为噬斑实验的结果有差异。通常测定3个不同稀释浓度的病毒所形成噬斑，共需要12块组织培养皿测定每种病毒储液的浓度（6块培养皿以1.5×106细胞/ml接种，6块培养皿以2×106细胞/ml接种）。 2.做病毒噬斑试验时，细胞单层培养物的密度很关键。如果培养5天后，噬斑仍然太小，则细胞接种太密；如果噬斑太大和扩散，则细胞接种太稀。对特定细胞系，可用一系列不同的细胞密度通过噬斑实验确定其最佳噬斑细胞密度。 3.如果重组病毒含有lacZ基因，如来自pBlueBacIII(Invitrogen)或pAC360β-Gal的重组体，在琼脂糖固化前加入150μg/mlX-gal（来自20mg/ml储存液，储存液由无菌的二甲基甲酰胺制备，-20℃可保存数月），重组体的噬斑因显示明亮的蓝色容易与非重组体辨别。 4.步骤5中，若使用加湿的27℃培养箱，培养皿无需用Parafilm膜封住。 5.噬斑持续形成至2周。如果在2周时还看不到噬斑，可能由于细胞接种密度过高所致，应该以较低密度（在1×105和1.3×106细胞/平皿之间）重新接种。 其他 | 展开 |
