【求助】[求助] 溶菌酶破碎大肠杆菌
2008-12-04
问题描述:
我打算做蛋白提取,以前单纯用超声效果不好,为了尽量保留活性,选择用溶菌酶见超声破碎的方法。
我按照分子克隆上的步骤:
1.菌体称重为0.4g,加PBSbuffer3ml(PH=8.05),充分混匀。
2.加现配的50mg/ml溶菌酶溶液240微升,至终浓度4mg/ml。冰置3小时。
3.超声400w,10s,10s,40次,结果目测还是乳白色,镜检很多菌体。
为什么破不开,搞不懂,我前几天做预实验的时候,还能变澄清???
注:预实验的步骤与现在的一样,只是菌体重量是0.1g加PBS3ml,再加溶菌酶至1mg/ml,超声400w,10s,10s,20次。
麻烦大家能给以帮助,先谢谢了...
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skykiller
用户
破菌时,不要太在意所谓的乳白色、澄清之类的东东,也不要过分相信镜检。简单的方法就是电泳,破菌离心后做个上清和沉淀的电泳就行了。我们一般破菌(E.coli.),就是1g菌加10-20ml缓冲液,冰水浴超声4s/4s,400-500W,99次*2,就可以了。你的溶菌酶加得太多了吧,我不知道具体用量,但4mg/ml肯定是过了。从纯化的角度看,加入了这么多杂蛋白,不可思议。
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