【求助】请教RTPCR的组织处理！！！！

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2008-10-17

问题描述：

大家好！我做的是小鼠肝脏和脂肪的RT-PCR，解剖小鼠后是这样的程序：取肝脏和脂肪组织-----称重------将部分肝脏组织用于组织切片的病理观察，部分用于RT-PCR实验（脂肪组织处理同肝脏组织）。现在想请教一下，肝脏和脂肪取出、称重、分割后应该怎样冷冻处理用于RT-PCR实验？整个称重和分割的过程是否可以在常温下进行？通常所说的“迅速冷冻”这个迅速的时间具体是多少？如果超过多久没有放于-80度的冰箱里，会使RNA讲解呢？（我的实验需要把这些组织送往分子实验室做RT-PCR，所以存在运输的过程，应怎样运输和保存？）
谢谢您的帮助！我是药学专业的，一直在做动物的药效试验，以前没有做过分子实验，忘各位指点:)

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civcul

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1、肝脏和脂肪在取出处理后应该尽快冷冻，尽量缩短时间，最好放入液氮中冷冻。整个称重和分割的过程可以在常温下进行。2、处理完毕通常所说的“迅速冷冻”，一般是指液氮冷冻。如果没有，-80度应该是2h以上吧，至少得冻住吧。处理过程尽量减少RNA酶的污染，戴手套、剪刀镊子在酒精灯上处理等等。不知道你的运输过程需要多长时间？液氮运输最好，没有，就在-80度冻好后，装在保温盒里，里面放上冰块运输，中间过程别让化冻即可。肝脏RNA提取与一般组织RNA提取方法差不多：取100 mg新鲜的大鼠肝脏组织，加入到无RNase含1 mL Trizol试剂匀浆1 min，室温静置5 min。加无RNase的氯仿0.2 mL，振荡15～30 s，室温静置2～3 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min；小心吸取上层水相，移至新的EP管中；加未用过无RNase的异丙醇0.5 mL，充分混匀，室温静置10 min；4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min；弃上清，加用DEPC水配制的体积分数75%乙醇1 mL，振摇，充分洗涤沉淀，4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min；弃上清，真空干燥，加5～10 μL无RNase三蒸水熔解沉淀。OD260/OD280值大约2.0左右。但是脂肪组织RNA提取方法不用于以上方法：以脂肪组织为材料提取高质量的总RNA存在以下两方面的问题:第一,脂肪组织单位体积细胞数少, 且单位细胞富含脂类RNA 含量相对较少，每毫克组织样品所得总RNA的量小于0. 05μg,因而所提RNA的得率较低，增加了从脂肪组织提取RNA 的难度。;第二, RNA 产品中常伴有基因组DNA污染,当使用这种RNA制品进行RT - PCR定性分析时,基因组DNA 可直接充当PCR模板,造成PCR假阳性结果。脂肪组织TNA提取注意问题：1、在液氮中研成粉末后（脂肪组织不要取得太少，要新鲜、研磨一定要充分），不要刮到EP管里，否则会损失很多，直接在粉末中加入Trizol，这时Trizol会冻住，将冻住的Trizol继续研磨成粉末，等Trizol重新融化为液体后，用枪吸到EP管中。也可以将研磨好的粉末取到离心管后再加TRIzol，前提是粉末量要大。因为一是降低损失，二是脂肪本身含RNA量低。2、推荐使用QIAGEN公司的RNeasy Lipid Tissue Kits（Cat no.74804），优点是它是专门针对脂肪组织设计的试剂盒，具有组织优化的裂解液QIAzol Lysis Reagent。参考文献：脂肪RNA提取.rar(179.74k)

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smile1_马

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看到了您的留言，万分感谢您的悉心讲解！！！！谢谢您，我会好好阅读并尝试:)

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luwudaoman

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学习一下。RNA

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