采用碳二亚氨法和戊二醛法都能连接半抗原使之成为完全抗原。这二种方法在网上可以详细的搜索到。免疫动物后得到的抗体都是多抗，只有经过单克隆筛选后才能得到单抗。

非常感谢这位战友

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介（一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联）1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutylchloroformatemethod）偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixedacidanhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法1、5．8mgMIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。2、1.5mg酶用2ml50mmol/LNa2CO3溶解。3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。4、过sephadexG-25层析柱，柱用含NaCl100mmol/L、MgCl210mmol/L、2-巯基乙醇10mmol/L的50mmol/LTris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA0.1％（w/v）、NaN30.02%(w/v)的缓冲液中。2、碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤1、取EDC100mg,用pH8.0的10mmol/LPBS液2.5ml使之充分溶解（I液）2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg,用0.2mol/LNaOH溶液2ml溶解(II液)3、取血蓝蛋白(lemocyanin)25mg,溶于10mmol/LPBS（pH8.0）液中（III液）4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液6、4度搅拌12小时7、静置10小时（4度）8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。3、孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100mmol/L的溶液。2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)100mmol/L和DCC（二环已基碳化二亚胺），200mmol/L,4度反应16小时。3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1)4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50mmol/L的磷酸缓冲液溶解）中。5、（二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联1、芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤1、用0.1mol/LHCl溶液配制4mmol/L浓度的半抗原。2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50mmol/LKI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。4、用pH9.0、浓度为200mmol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。6、冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。7、用PBS透析2天8、-20度保存（浓度为20mg/mL）双功能的酰亚胺酯(imidateesters)可以氨基反应，形成脒。例如：用二甲基已二酰亚胺酯(dimethylADIpimide)将去甲基三正喋呤(desmethylmortriptyline)与β-半乳糖苷酶偶联。2、、应用双功能酰亚胺酯（imidateesters）制备去甲基三正喋呤-与β-半乳糖苷酶标记特的操作步骤1、用含5％（W/V）N-乙基吗啉的无水甲醇0.4ml,在室温下溶解570ug去甲基三正喋呤和488ug二甲基已二酰亚胺酯(dimethyladipimide)(A液)2、取与β-半乳糖苷酶100ug,溶于pH9.9的100mmol/L碳酸缓冲液（含MgCl210mmol/L,2-巯基乙醇10mmol/L0.1ml(B液)3、将A液倒入B液。4、20度反应90分钟后，加含NaCl100mmol/L,MgCl210mmol/L和2-巯基乙醇10mmol/L、pH7.5的Tris-醋酸缓冲液(50mmol/L)1ml,终止反应。5、过sephadexG-25,去除小分子物质，得酶标记物（约75％的酶与半抗原结合，但用三正喋呤代替去甲三正喋呤(demethylmortriptyline)进行偶联，则只有15％的酶与之结合。（三）含巯基半抗原的偶联可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺(bromoacetamide)激活。或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。（四）含羟基的半抗原偶联醇类羟基通过形成半琥珀酸酯转化为羧基的操作步骤1、15g2,2,2-三氯乙醇（2,2,2-trichloroethanol）,12g琥珀酸酐(succinicanhydride)和8.7ml三乙基胺(triethylamime)用100ml乙酰乙酯溶解。2、加热回流1小时。3、减压蒸馏去溶剂，,残余物用5%NaHCO3水溶液溶解。4、用乙醚洗涤两次，然后用H2SO4进行s酸化（pH到2.0）.5、用水洗涤固形物（为三氯乙基半琥珀酸酯）两次，用氯仿-已烷使其结晶（产量约75％，熔点88-89度）6、取2.5g半琥珀酸酯溶于6.5ml亚硫酰氯(thionylchloride)中，65度加热30分钟。7、减压蒸发，干燥1小时（高度真空条件下）。8、将上述产生（2，2，2-三氯忆基琥珀酰氯）溶于15mlN,N-二甲基-乙酸乙酰胺(N,N-dimethylethylacetamide)中，室温搅拌反应2小时。9、65度真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来（得盐酸化的结晶---5`-酯约84％，熔点160度）。10、用溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得f半抗原-半琥珀酸酯，这样引和的羧基可与蛋白质偶联（如用碳化二亚胺化）。半抗原用NaIO4氧化其中的糖苷醇后再与蛋白质偶联的操作步骤1、20mg腺苷溶于1ml100mmol/LNaIO4溶液中，4度避光反应30分钟。2、加1滴乙二醇(得A液)3、将A液加入到β-半乳糖苷酶液（20mg/ml,用150mmol/LNaCl,10mmol/LMgCl2水溶液溶解，用3％K2CO3调节pH至9.0）中4、4度反应2小时，期间不断调节pH9.05、加入临时配制的50mg/mlNaBO4溶液，用量为反应体积的1/10。4度反应过夜。6、用含有MgCl210mmol/L,2-巯基乙醇10mmol/L、NaCl100mmol/L的50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)透析(更换透析液数次)（五）含酮基或酮基半抗原的偶联是将酮基经羟胺类化合物处理变成肟类化合物，再进一步将肟类化合物中的羟基，衍变成羧基化合物，再进一步进行含羧基半抗原的偶联操作。这类羟胺类化合物主要有：氨氧乙酸aminoxyaceticacid或羧甲氧胺carboxymethoxylamine或者盐酸羟胺酮基的类固醇分子中引入羧基的操作步骤1、在200ml乙醇中，加入O-(羧甲基)羟胺（O-(carboxyl)hydroxylamine）和酮基半抗原，使其浓度分别为10mmol/L和4mmol/L2、加热回流90分钟3、旋转蒸发，减少容积，然后加水至40ml，用乙醚抽提4、用水洗涤乙醚抽提物，用Na2SO4干燥成白色粉末。（六）、其他半抗原的偶联虽含有游离基团，但因这些基团对于维其生物活性十分重要，因些不能直接用来与载体蛋白偶联。制备雌二醇-6-肟的操作步骤a、雌二醇二醋酸盐的制备1、1g雌二醇溶于14ml吡啶及3.5ml醋酐中2、加热回流1小时，冷却后倾入冰水中。3、收集白色晶体，得产物约1.1g（熔点126到127度）b、雌二醇-6-酮-二醋酸盐的制备4、雌二醇二醋酸盐1.1g，滴加冰醋酸3.8ml溶解后加含0.93gCrO3的含水冰醋酸6.35ml(H2O:Hac=0.75:5.6)5、室温搅拌1小时，静置24小时6、用水稀释，用乙醚提取4次7、用蒸馏水洗2次8、减压蒸馏，得结晶油状渣物。9、用90度烘干20分钟，得粗制品约500mg10、用11ml无水乙醇溶解粗制品，再加1.1ml冰醋酸及1.5g吉纳你特T试剂(GiradT)，回流1小时。11、冷却后，用冰致冷的蒸馏水稀释，用2.5mol/LNaOH调节pH至6.0-6.2.12、用乙醚抽提3次，弃去乙醚。13、水层用浓盐酸酸化（盐酸终浓度为1mol/L).14、室温静置2小时。15、用乙醚抽提3次。16、合并乙醚抽提液，用0.125mol/L碳酸钠溶液洗1次，用蒸馏水洗3次。17、用无水硫酸钠脱水，蒸干。18、加7ml醋酐，回流20分钟。19、冷却后倾入用冰致冷的蒸馏水中，然后过滤、干燥得产物约176mg(熔点为162-166度)c、二醇-6-酮的制备20、用5.5ml20％的氢氧化钾-甲醇溶液(W/V)溶解雌二醇-6-酮-二醋酸盐（176mg）,在室温下于氮气中水解24小时。21、加蒸馏水稀释，用乙醚抽提3次。22、在乙醚提取液中无水硫酸钠进行脱水，蒸发干燥，得产物约60mg(熔点为278-282度)d、雌二醇-6-肟的制备23、取雌二醇-6-酮50mg,盐酸羧甲基羧胺50mg,溶于20％含水甲醇(V/V)7ml和1mol/L醋酸钠4ml中，回流1.5小时。24、减压、蒸馏、浓缩后，加蒸馏水20ml25、用2mol/LNaOH调节pH至8.5。26、用醋酸乙酯抽提4次27、水层用1mol/L盐酸酸化至pH2.5。28、用醋酸乙酯抽提4次29、合并抽提液，蒸干，得产物约100mg(结晶熔点约186-188度)其他半抗原如：青霉素、生物素、地高辛、荧光素等半抗原交联。