浅述蛋白质分离纯化的新技术

摘要：本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术，综和近年来国内外的一些研究结果，结合实际应用的例子，分析了各种分离纯化方法的优点，同时指出其不足之处。文章最后展望了蛋白质分离纯化技术的发展趋势。关键词：分离纯化蛋白质进展生物技术的发展非常迅速，基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已经能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。和其它生物产品的生产过程一样蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。本文主要综和近年来国内外的研究结果，介绍了蛋白质的最新分离纯化技术。2.蛋白质的分离纯化方法：2.1浊点萃取法(CPE)：2.1.1概念及原理：浊点萃取法(cloudpointextraction，CPE)〔1〕是近年来出现的一种新兴的液—液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中[2-5]。CPE法除了利用增溶作用外，还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。溶液静置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相：一为表面活性剂相(约占总体积的5％)；另一为水相(胶束浓度等于CMC)。外界条件(如温度)向相反方向变化，两相便消失，再次成为均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白，与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进表面活性剂相，亲水性物质留在水相，这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。温度的改变，引起水化层的破坏，增强了表面活性剂的疏水性。2.1.2蛋白质分离纯化中的应用：CPE法可用于分离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体，还可以替代一些分离方法如硫酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步，与色谱方法联用。另外，CPE法分离纯化蛋白质已经可以实现大规模操作。Minuth等人成功地进行了胆固醇氧化酶浊点萃取的中试研究。虽然使用离心分离器可以使CPE大规模连续进行，但商品离心分离器用于CPE的效率和容量仍需进一步研究。而且，他们发现相分离操作受细胞培养时产生的表面活性物质影响较大，体系两相间密度差较小，表面张力较小，含产物的表面活性剂相的流变学行为较复杂，操作较难。表1列出了CPE法近几年来在蛋白质分离纯化中的应用。(1)CPE法用于分离纯化膜蛋白膜蛋白(内嵌膜蛋白、外围膜蛋白)硫水性强、难溶于水，抽提内嵌膜蛋白时，既要削弱它与膜脂的硫水性结合，又耍使它保持硫水基在外的天然状态，较难分离纯化。由于表面活性刑具有两亲性，它一直作为腹蛋白理想的增溶剂。增溶时，膜蛋白琉水部分嵌入胶束的硫水核中而与膜脱离，又保持了膜蛋白表面的废水结构。相分离后，膜蛋白与表面活性剂共同析出，与亲水性蛋白质分离。所以，CPE法在分离纯化膜蛋白方面极有优势。(2)与其它分析技术的联用CPE可以作为高效液相色谱(HPLC)、流动注射分析(FIA)、毛细管电泳(CE)等仪器分析的样品前处理方法，提高检出灵敏度。表面活性别可以防止样品吸附在玻璃容器上，易于与FIA中的载液及HPLC中的有机流动相或胶束流动相混合，可以直接进样。但是在很多应用中需要除去表面活性剂后再与仪器联用。将萃取物与表面活性剂分离的方法很多。对于CMC＞1mM的表面活性剂如两性离子表面活性剂可用透析法，但操作时间较长(24h左右)。对于CMC较小的表面活性剂可通过色谱柱分离除去，如凝胶柱、毛纫管柱等，分离出的表面活性剂可以再利用，也可以作焚烧处理。但CPE作为HPLC的样品前处理方法有两个缺点：第一，常用的表面活性剂在UV区域有很强的背景吸收。第二，操作时间较长，从色谱柱上需用几个小时洗脱表面活性剂。表面活性剂的洗脱可能会干扰分析物的测定[3]。2.2置换色谱法：2.2.1概念及分离机理：置换色谱(displacementchromatography)〔6〕作为一种非线性色谱技术，是指样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂(displacer)通人色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱[7]。置换色谱的分离行为与样品组分和置换剂在实验条件下的吸附等湿线有直接的联系。置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等湿线应为Langmuir型，而且置换剂相对于被分离的各组分应有最强的吸附能力，其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的上方[7]，见图1(A)。根据物料平衡方程，置换剂在柱中的移动速度uD有下列关系：式中uD为流动相的线速，ф为相比，qD和cD分别为置换剂在固定相和流动相中的浓度，qD／cD是直线OD的斜率，称之为操作线(operatingline)。当操作线的斜率小于被分离组分等温线的起始斜率，样品才能进行置换展开，最终形成如图l(中的置换序列，这是在理想的情况下(假定无轴向扩散及二次化学平衡)获得的置换色谱图。每一组分形成矩形的平台(Plateau)洗脱峰，相邻各组分的平台洗脱峰组成了一个台阶状的色谱图。此时，样品中不同的组分以置换剂的速度前进，即达到等速状态(isobathicconditions)：uD＝u2；u3＝u4式中u2、u3、u4指被置换的三组分的速度2.2.2影响置换色谱分离的因素：（1）置换剂置换剂的选择是置换色谱能否成功地分离和纯化目标产物的关键因素之一〔7,8〕。对于蛋白质生物大分子的置换色谱来说，多离子型的置换剂与离子交换续料相结合是目前常用的分离方式。传统观点认为分子量相对大的聚电解质是较合适的置换剂，因为它们对固定相的结合比分离物更强，如羧甲基葡聚糖(CMD)、硫酸葡聚糖、羧甲基淀粉(CMS)〔9〕、硫酸鱼精蛋、肝素、多硫酸戊聚糖(PPS)等。近期的研究表明，低分子量的化合物作为置换剂则更有优势，因为即使置换剂与蛋白质产物的峰有叠加，在后处理过程中，低分子量置换剂则较容易从目标产物中分离；同时，合成低分子量置换剂成本较低，色谱柱再生过程也比分子量大的置换剂快。（2）固定相理想的固定相应具备以下条件：样品及置换剂在固定相上应有较强的吸附作用，且吸附是可逆的；样品及置换剂在固定相上的吸附等温线应为Langmuir型；样品各组分在固定相上的吸附能力应有较大差别，以保证置换色谱带的交叠部分尽可能小而获得良好的产率；有较好的化学稳定性，可适用于不同pH值的缓冲液和有机溶剂；有较大的比表面及吸附容量；有较好的机械强度，而且容易再生。置换色谱中的环境不同，置换效果也不一样，即使是选用同样的硅胶，由于来源和制备方法上的差异也会影响置换效率。反相色谱中使用的烷基硅胶柱常被应用于置换色谱。同其它硅胶固定相相比，烷基硅胶柱由于柱容量低及非选择性吸附等缺点，很少被用于洗脱色谱，但它却可以用于置换色诺，并成功地分离了对映异构体。1、问题：电渗纯化蛋白质，结果几乎没得到蛋白，请问哪位有高见今夜纯化蛋白，本以为唾手可得，结果却大失所望....我用SDS-PAGE分离，KCL显带，割胶，而后电渗分离，测OD值极低，请问哪位有这方面的经验或其它方法，望赐教。解决：多挖点胶，收集起来，放在1.5离心管里，用PBS捣烂，4度过夜。然后离心，收集上清即可。最后，把上清冻成干粉。2、问题：蛋白质提纯的方法：SDS-PAGEandN-terminalaminoacidsequenceanalysis.（dahuaidang）SDSpolyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)wasperformedin12%acrylamideand0.1%SDSwithADIscontinuousTris-glycinebuffersystem.PurifiedenzymewassubjectedtoSDS-PAGEandelectroblottedtoImmobilo-PSQ0.45μmpolyvinylidenefluoridemembrane(Millipore).AfterthemembranewasstainedwithPonceauS(Sigma),theenzymeproteinwascutoutandwashedwithmethanol.ThemembranestripholdingtheproteinwassubjectedtoautomaticEdmandegradationforsequencingoftheN-terminalaminolacidsusinganAppliedBiosystems477Aproteinsequencer(ParkinElmer).3、问题：蛋白质纯化，装柱，过柱应注意事项有哪些？（dahuaidang）现在要进行蛋白质纯化，有关装柱和过柱的注意事项有哪些呀？还有，需要测序的蛋白质样品，大概需要多少，样品要求有哪些。柱子sephadex-200,和DEAE-纤维互素。第一，手工装柱一般只适宜于大量蛋白质的提取。分子筛柱一般在盐析以后用效率才高，因为它的分媛实汀Ｒ话阄叶荚蕹捎茫龋校蹋弥颍疲校蹋弥?Gelfitrationcolumn).如果手工装柱，长度应是内径的６０－８０倍，一般柱长应在1.2-2米，对于软胶，走一次柱须１２小时以上，对硬胶，也需５－６小时。第二，仪器检测器灵敏度调整：最重要的是确定仪器工作正常，信号相应正常。可用在检测器出口通气泡和检测器入口注射有色样品的方法确认仪器正常和估计灵敏度。第三，均匀,无气泡，平衡充分，分子筛要注意长度与直径比。测序的蛋白量"我用的方法的量是SDS-PAGE第四，如果是测序的话,跑SDS-PAGE,把染出的蛋白质带,挖下来.,直接拿去做质谱,只要你有钱国家生物医学分析中心。还有就是要保证挖的是一个蛋白质带,不能含杂蛋白质的,不然,把杂蛋白质测了怎么办。第五，测序跟质谱不是一回事儿的。做质谱可以做分子量和质谱图，但是未必是序列。序列是要单测的。北大有位老师可以做：180块钱一个氨基酸。做质谱多得是：测分子量大约是450块钱了，测图谱的要一千多块。4、问题：跑SDS-PAGE有好多带，而过柱时却没有峰，原因是什么？1、会不会是洗脱太快。2、查查有没有断层。3、SDS-PAGE分离能力强,而在柱子FRACTION中几个低峰依次串在一起就不明显了。4、上柱前样品要浓缩，保证样浓度不能太低。如没浓缩，检测仪的量程又没选好，可能看不出来。5、Sephadex是Amersham公司经典的层析填料，有很高的选择性，不同颗粒大小的填料有不同的分离范围，主要用于凝胶层析（亦称分子筛）。粗颗粒流速较快，细颗粒流速较慢，但分辨率较高。Sephadex200的分离范围（以球蛋白计）是5－60kDa。这种填料的另一个优点是较便宜。（也够贵的）现已被新一代Bioprocess填料代替。DEAE--纤维素我没用过，应该是用于离子交换吧。这是一种弱阴离子填料。以下情况都是正常的：1，没有峰的部位有带。可能吸收低上样量少或者检测手段不对头（最麻烦，好像只好分部收集了，但是一般情况下，首先考虑的是找到更合适的检测手段）。2，一个很好的峰的部位有很多带。这个就没有必要解释了。3，有峰的部位没有带。可能是有紫外吸收的小分之或者降解的短肽（这个最可恨）或者在电泳中间分子量太小跑到顶端了等等。4，同一个蛋白出现在不同的部位。在离子交换中可能是电荷分布不对称。上面的所有的还有一个可能就是柱子有问题，那我就不好说了。但是我用到的都是世界上最好的公司的预装柱，所以我就不考虑了。还有的情况是上面的1、4同时出现，那真是要把人气死！！！至于说拖尾，刺峰等等都很常见。而且首先大概就是考虑柱子效率下降了或者坏了。呵呵！！！5、样品浓度多少才不算低？0.8mg/ml的蛋白质浓度算不算低。我不太想用透析袋浓缩，那样会丢失好多样品。想直接加样，洗脱。还有，上样体积问题？2.6*96cm柱子，上100ml的样品怎么样？最后一个问题，样品中含有少量edta会不会有影响？1、如果是离子交换，上样浓度太大反而不好，这样子动态载量会减小；2、如果是凝胶层析，上样浓度要尽量大些，道理和电泳一样，样品在跑的过程中不可避免地会被稀释，变得"broad"，杂质和目标蛋白的洗脱峰就有更多的部分重叠，影响纯度。3、关于凝胶层析的上样量，通常是柱体积的2－5％，太多会影响分离效果。你的上样量显然太大了。在现有条件下，可以通过连续批次上样，即不等前次样品跑出柱子，就第二次上样，通常可以做到一个柱体积上两次样，这样子可以节省时间和试剂。但要具体摸索。4、至于量程的设定，我建议先用缓冲液回零，再用注射器或泵将样品注入检测器，调至满刻度，应该差不多了。5、edta是常用的生物缓冲液的成分之一，它在某些情况下会影响层析，具体情况具体分析。6、什么叫连续批次上样？具体我应该怎么fumble呀，我还从没听说过这个词呢。还望指教。一般情况下，上柱的样品跑出柱子后，根据紫外或电导或其他检测器的情况分部收集完成后，才开始第二次上样，需要用至少一个柱体积的缓冲液。这种情况下，绝大部分缓冲液是用于将样品“冲”出柱子，尤其是后半部分的缓冲液。有些浪费。这部分缓冲液的完全可以再上一次样品，适当地调节两次上样的间隔，可以做到两次样品完全分开而不会重叠，从而一个柱体积的洗脱中可以两次上样，节省试剂，缩短时间，即所谓“连续批次”。这是相对通常情况下而言的。7、例子：样品是用10mMTris-Cl,pH7.4(含10mMEDTA),而流洗缓冲是30mMTris-Cl,pH7.9,我自己认为这样应该不会有太大影响吧，希望有知情者告知。好让我下次改正。分析：根据你的描述，看来你是在用Sephadex26/100做凝胶层析。1、凝胶层析主要用途有两个，一个是在其分辨率范围内根据分子大小进行分离，常用于蛋白质纯化的最后一步，即精细纯化（polishing），由于样品体积明显影响分离速度和分辨率，故很少用于粗提纯。另一个用途是脱盐/缓冲液置换，即将蛋白或其他大分子量的组分与无机盐等小分子组分分开。常用于不同层析步骤之间的缓冲液置换，使得样品与待使用的缓冲液成分尽量一致。目前Amersham公司的填料中SephadexG25较常用于这方面。2、如果你的凝胶柱子用于蛋白质的分离纯化，如我前所提，分辨率至关重要。装柱的效果直接影响分离效果。装得不好的柱子是对填料的浪费，尤其是用好的凝胶。不知道你是否测过这个柱子的柱效？合格的SephadexG100柱子的每米理论塔板数应在3000－6000之间。如果低于3000，最好重装。3、平衡也很重要。柱子装完后，要用和上样缓冲液尽量相同的缓冲液平衡，流速也与上样尽量一致，平衡至少5个柱体积，让填料“喝饱”，即流出的液体和进的液体成分尽量一致，有时紫外检测器的走线平稳并不一定意味着平衡完成即是如此。连续上样过程中，也要适当进行平衡，比如3－5次上样后平衡2个柱体积，对柱子的分离效果和寿命都有好处。8、问题：823a型紫外检测仪——3057型便携式记录仪。我不明白这种组装是啥道理？是通过什么信号使得记录仪能够记录到，由检测器检测出的信息。所以我在操作时，不知道怎么调节。那些按钮之间的关系？1.短接记录仪，记录笔应回到机械零位，否则调之；2.接通检测器，检测器中充满1mg/ml的蛋白质溶液（如Albumin），调节检测器的信号输出（通常是用电压标识mv），使记录笔接近100％满刻度；3.检测器中充满缓冲液，看记录笔的位置，最好接近～10％刻度的地方，这样防止出现吸光度值低于缓冲液无法记录的情况；如果笔位太高，应增大检测器信号输出，重新按步骤2调节；反之降低信号输出；有的记录仪也可调节输入信号的范围，这样子就更方便了。满刻度的调节要视具体应用，不一定是1mg/ml的蛋白浓度。9、aboutdimensionofcolumn:（davidzrock）"Thechoiceofinnerdiametermaybebasedonthedesiredsampleloadoronconsiderationsoftheextradispersioneffectsfromthewallregion,whichextends20particlediametersawayfromthewall....Thelengthofthecolumnisprimarilychosenaccordingtotheresolutionthatisrequired.""Thedimensionsmaybechosenaccordingtotheapplicationathand,butmostlaboratorycolumnshavea4-to16-mminnerdiameter(i.d.)andalengthof25to70cm."-----From‘ProteinPurificationprinciples,HighResolutionMethods,andApplications’2ededitedbyJ.C.JansonandL.Ryden"Theresolutionoftwoseparatedzonesingelfiltrationincreasesasthesequarerootofcolumnlength.Longcolumnsshould,therefore,beusedtoobtainthebestresolutioninanalyticalfractionation.Bedheightsofgreaterthan1mareseldomrequired.Ifaverylongbedisjudgedtobenecessary,theeffectivebedheightcanoftenbeincreasedsimplybyrecyclingorbyusingcolumnscoupledinseries."从amersham商品化提供的预装柱能看到，没有超过1m的。很长的柱子装填难度极大。装得好的柱子一根可以当两根用。关于手工装柱，取决于装柱操作者的经验，完全可以比预装柱的效果好，而且可以根据试验的具体情况改变柱子参数。但预装柱的优点是方便、省事，很适合对柱子和填料进行"scaning"。另外工业化的层析要求是重复性，“对人是不信任的”，而不要求最好的效果，只要满足要求即可。这时就要有装柱设备（packingstation）了。现应用于工业生产的凝胶层析柱直径已超过1m。10、在室温下的柱子，怎么保证其胶不发霉1.柱子装填和使用过程中要注意减少微生物的污染，如对缓冲液和样品等进行澄清、除菌过滤。低温并不能保证无菌生长。2.柱子在使用过程中，要定期进行在位清洗/消毒（SIP/CIP，sanitization/cleaninplace）。如1MNaOH处理1hr，可有效地减少微生物污染。具体使用哪种消毒剂以及消毒方法，请参阅凝胶及空柱使用说明书，避免损害凝胶柱。如你没有，我可帮你查。3.柱子长期不用时，为防止微生物生长，建议在位保存。如用10mMNaOH或20％乙醇将柱内的液体全部置换出来，存放在建议温度下（不一定是低温）。使用前再进行冲洗和平衡。也可将凝胶取出，保存于上述溶液中。4.如有微生物生长，应进行灭菌处理，如1MNaOH或取出凝胶进行高温灭菌，具体方法亦需事先参阅说明书。FromAmershamAntimicrobialagentsforchromatographyAqueousbuffersolutionswilloftensupportgrowthofmicro-organismscommonlyfoundinlaboratories.Sinceitisdifficulttocleancolumnsthathavebecomeheavilycontaminatedwithmicroorganisms,precautionsshouldbetakentoavoidgrowthinthecolumnorinbuffervessels.Alwaysusefreshbuffersolutionsandcoverthebuffervesselstokeepoutdust,sporesandotherparticles.Ifacolumnwillnotbeusedformorethanacoupleofdays,itshouldbeequilibratedwiththebacteriostaticagentdescribedinthemanualsuppliedwiththeseparationmediumorprepackedcolumn.Werecommendethanolorsodiumhydroxideforgeneraluse.Theseagentsareeffective,inexpensiveanddonotcausedisposalproblems.Ethanol20%ManychromatographymediafromAmershamBiosciencesaresuppliedasasUSPensioncontaining20%ethanol.Ethanol,20%,canalsobeusedasanalternativetoNaOHforstoringchromatographymediaunderbacteriostaticconditions.ItshouldnotbeusedforcolumnspackedwithSephadexG-typesandothermediabasedonSephadexsincethebedwillshrinkandspoilthepacking.SodiumhydroxideSodiumhydroxide,0.01M,isaneffectivebacteriostaticagent.Athigherconcentrations(0.5-1.0M)itisaneffectivesanitizingagentforcontaminatedcolumns.Forthemostfrequentcontaminantsinchromatographicsystems,suchasgram-negativebacteria,agoodbactericidaleffectisreachedevenatconcentrationsaslowas0.01MNaOH.Treatmentwithsodiumhydroxideinactivatesendotoxins(LPS)andwill,inmanycases,solubilizesubstancesprecipitatedonthecolumn.Itslowtoxicityisanadvantagethatreducestheriskofsamplecontamination.SodiumhydroxideisnotrecommendedforusewithSepharoseorforstorageofSephacrylHR.11、层析关于装柱和使用，主要有几点要注意的：（davidzrock）1、装柱前要仔细看填料的使用说明书，每种填料都有自己的特性，以及特殊的装柱方法，针对不同的空柱，也要注意方法可能不同；2、填料要加水搅拌成均匀悬液，悬液浓度依填料而不同，一般70－85％，迅速倒入空柱内，或吸或压，流速和具体步骤看说明书。3、这一点非常重要：装柱包括以后使用中绝对不允许柱内进入气泡（bubblefree），柱头事先也要排除气泡。4、选择合适的泵，首先是流速满足要求，脉冲尽量小。首选柱塞泵。5、所有柱子尽量做到填料均匀，尤其是用于凝胶层析的柱子。装柱完成后，可用柱效测定的方法检查装填效果。一个装填合格的柱子的理论塔板高度应是填料平均粒径的2－4倍，在此范围内越小越好。6、准备上柱的液体应进行过滤，至少是0.45micrometre。7、至于测序，我想大概不到1mg应该足够了。8、关于纯化，首先要考虑的是你的目标：纯度、数量、速度、收率等等，再根据样品的具体情况，尤其是目标蛋白的性质，确定纯化策略。通常三步曲：capture、purification、polishing。第一步先从大量或复杂样品中将目标蛋白“抓出”，与主要杂质分离；再用高选择性的层析去除绝大部分杂质；最后精细纯化，提供纯度至设定目标。到实际工作中，不要死靠三步，也许一步也许四步或更多，具体情况具体分析。所谓“三步”只是一种思路而已。