【求助】RNA的纯化不用试剂盒行吗？

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【求助】RNA的纯化不用试剂盒行吗？

2021-08-16

问题描述：

请问大家，我的体外转录的RNA想纯化后用于细胞转染。如果该RNA不用试剂盒纯化，只用trzol等纯化行吗？效率高吗？你的具体方法步骤是什麽？望有经验的朋友指导。谢谢:)

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applepie118

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可以，以下时RNA纯化1）用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚，先加入酚后加入氯仿。①核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚/氯仿（如有20ul样品，则加入10ul酚10ul氯仿。②旋涡混匀管内容物，使呈乳状。③12000×g室温离心15秒。④水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。⑤重复步骤①－④步操作，直至两相界面上见不到蛋白质为止⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸2）2－8度，离心，10500rpm/min，15min,取上清，用200ul在20ul刻度使用，小心不要使界面混淆，剩余界面上不要）3）上清中加入等量的异丙醇(一般是0.5:1),颠倒5次（用200ul枪加小心），室温静置10min7. 2-8度离心，10500rmp/min,10min,弃上清8. RNA洗涤：75％酒精（这次用的100％。未影响）1ml沉淀，轻轻弹其底部（直接放入－70度冰箱可以长期保存，静置几秒钟9．2－8度离心，8500rpm/min,5min ,弃上清10．取出滤纸，将EP管敞开放在滤纸上，管口向酒精灯（不要完全干燥，不好溶解）11.DEPC水溶解（30ul,可变），分装,2ul电泳，2ul比色，其余5ul分装至于手套中冻于－20度中结果仍旧不是很理想，测得的OD260/280=1。所以怀疑有DNA污染：1．使用TRIZOL再抽提一次2．除去DNA的分子克隆书上的方法：1．材料：TE缓冲液（10mmol/lTris.HCL,PH7.4,1mmol/lEDTA,ph8.0100mmol/Lmgcl2/100mmol/Ldtt2.5mg/ml DNA酶1胎盘核糖酸梅抑制剂 DNA酶反映中止液2．步骤：3．1。冰预中配置：100mmol/l MGCL2/100mmol/l DTT10ul2.5mg/mlDNA酶0.2ul核酸酶抑制剂0.1ul(25-50U/UL)TE39.7ul加入RNA 反映液中，混匀。37°温预15min3加入25ulDNA酶反应中止剂，以酚/氯仿/异丙醇＆氯仿/异丙醇抽提一次4，加入325ul乙醇再冰上沉淀15－30min,－20过夜结果;使用TRIZOL再提取一次后，浓度较低，纯化后有纯度升高。RNA:OD260=0.695.OD280=0.410OD260/OD280=1.8我的步骤，以及经验

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