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2x GoldStar Best PCR Master Mix (with dye)
Name | 2x GoldStar Best PCR Master Mix (with dye) | ||||||||||||||||||
Cat. # | W0655-1 $ 39.00 (1 mL, 100 rxn, 20 ul/rxn) $159.00 (5 mL, 500 rxn, 20 ul/rxn) How to pay with  | ||||||||||||||||||
Application |
This product is for research use only. | ||||||||||||||||||
Specifications |
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Description and features | 2x GoldStar Best PCR Master Mix (with dye) is a convenient premixed 2x concentrated solution for PCR which include GoldStar Best DNA Polymerase, PCR Buffer, Mg2+, dNTPs, PCR Stabilizer and PCR Intensifier. The polymerase has a 5´→3´ DNA polymerase and a 5´→3´ exonuclease activity.It also possesses 3´→5´ exonuclease (proofreading) activity. The polymerase has a higher amplification efficiency and lower mispairing rate than routine Taq DNA polymerase. The GoldStar Best is a high reliable hotstart polymerase, which activity is inhibited at ambient temperatures by the chemical modificaiton. This prevents the formation of misprimed products and primer dimers at ambient temperatures. GoldStar Best Polymerase is activated by a 10 minutes, 95°C incubation.Optimized buffer system promotes the amplification of target fragment with high fidelity, high specificity, high amplification efficiency and high sensitivity. GoldStar Best DNA Polymerase catalyzes the non-template directed addition of an adenine residue to the 3´-end of both strands of DNA molecules to make it suitable for TA cloning. The amplification range of Es Taq is ~ 6 kb. This PCR Master Mix contains dye, and can directly run electrophoresis after PCR reaction. | ||||||||||||||||||
Shipping / Storage | Ship at 4℃. Store at -20℃ for up to 1 year and avoid freeze-thaw cycles. Stored at 4℃ for up to 3 months. | ||||||||||||||||||
Quality control | This product is tested for no exogenous nuclease activity;no host DNA contamination tested (by PCR);able to amplify single copy gene from multiple genomes; and no significant enzyme activity decrease after storing at 2 ~ 8oC for 3 months. | ||||||||||||||||||
Manual (protocol) |  | ||||||||||||||||||
Components |
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PCR reaction system |  Note: The recommended primer concentration for PCR is between 0.1-1.0 µM of each primer. The use of higher concentrations of primers can have higher amplification effect. Low primer concentration will generally ensure cleaner product and lower background. | ||||||||||||||||||
PCR reaction conditions |  Note:
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PCR result examination | This PCR Master Mix contains dye for electrophoresis.After PCR, directly load 5 µL of PCR product to agarose gel to run electrophoresis.No need to add loading buffer. | ||||||||||||||||||
 | Exosome Isolation | Purity > 95% |
| Protein Extraction | 1 min total protein, 40 min membrane protein |
| 3D Cell Culture Gel | 30% < mkt=""> |
| PCR Kits | 50% < mkt=""> |
| Beta-Hexosaminidase Activity Colorimetric Assay | Fast and sensitive, High-throughput |
| Endotoxin-Free Plasmid Kits | maxi, midi and mini-prep |
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蚂蚁淘（www.ebiomall.cn）是中国大陆目前唯一的生物医疗科研用品B2B跨境交易平台，
该平台由多位经验丰富的生物人和IT人负责运营。蚂蚁淘B2B模式是指客户有采购意向后在蚂蚁
淘搜索全球供应信息，找到合适的产品后在蚂蚁淘下单，然后蚂蚁淘的海外买手进行跨境采购、
运输到中国口岸，最后由蚂蚁淘国内团队报关运输给客户...
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2021-09-12
产品名称： 小鼠肾损伤分子 elisa 国内优质ELISA厂家 产品简介： 小鼠肾损伤分子 elisa 国内优质ELISA厂家 ELISA试剂盒 国产现货 SIXIN生产的优质ELISA试剂盒直供全国。http://www.aatbio.com.cn/elisa/ 小鼠肾损伤分子 elisa 国内优质ELISA厂家 进口试剂采购网，上海通善生物科技有限公司（BioLeaf）旗下生命科学研究B2C一站式采购平台。 进口试剂采购网小鼠肾损伤 查看更多
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2021-08-31
聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction） (又称：多聚酶链式反应) PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核... 查看更多
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2021-08-08
H1-shRNA(RB)-Custom1 EagentargetGentargetGentarget/Customized lentiviral shRNA (H1) with RFP-Blasticidin marker/H1-shRNA(RB)-Custom/1 Ea 查看更多
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2021-08-26
武汉盛世华康生物医药科技有限公司在发布的酶抑制剂活性筛选供应信息，浏览与酶抑制剂活性筛选相关的产品或在搜索更多与酶抑制剂活性筛选相关的内容。 查看更多
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2018-03-20
北京五加和分子医学研究所有限公司在发布的miRNA生物传感器供应信息，浏览与miRNA生物传感器相关的产品或在搜索更多与miRNA生物传感器相关的内容。 查看更多
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2021-08-05
刊载在《Expert Opinionon Drug Safety》上的一篇文章综述了 5-alpha 还原酶抑制剂（5ARI）对性功能不良反应的影响。 5ARI 是治疗良性前列腺增生症（BPH）和下尿路症状的常用药，但也会引起性功能不良反应（勃起功能障碍、性欲减退和射精功能障碍），具体的发生率目前还不清 楚。非那雄胺和度他雄胺是目前临床用于治疗 BPH 的两种口服 5ARI。通过 PubMed 查询了从 1990 年到目前发表 查看更多
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2018-12-26
@font-face{font-family:"Times New Roman";}@font-face{font-family:"宋体";}@font-face{font-family:"Arial Narrow";}@font-face{font-family:"Symbol";}@font-face{font- 查看更多
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2021-07-22
吉满生物科技（上海）有限公司是Cas9载体构建技术服务商之一，从事Cas9载体构建已经多年。同时，生物在线为您提供众多企业Cas9载体构建技术服务，您可以搜索更多相关的Cas9载体构建实验技术服务，以便挑选到性价比高，合适的Cas9载体构建产品。而生物在线将会为您在Cas9载体构建方面提供全方位的解决方案。 查看更多
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2017-02-12
上海科汇生物技术有限公司在发布的科汇病理 日本进口记号笔 Duoline marker pen 包埋盒记号笔供应信息，浏览与科汇病理 日本进口记号笔 Duoline marker pen 包埋盒记号笔相关的产品或在搜索更多与科汇病理 日本进口记号笔 Duoline marker pen 包埋盒记号笔相关的内容。 查看更多
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2018-12-26
st1:*{behavior:url(#ieooui) } /* Style Definitions */ table.MsoNormalTable{mso-style-name:普通表格;mso-tstyle-rowband-size:0;mso-tstyle-colband-size:0;mso-style-no 查看更多
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2021-08-25
浅谈RT-PCR实验方法中常见污染问题及对策河南出入境检验检疫局技术中心 李轲反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和 查看更多
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2021-08-21
内质网绿色荧光探针（活细胞）是由上海前尘生物科技有限公司代理或销售的Yeasen品牌的试剂，产品来源于Yeasen。上海前尘生物科技有限公司是中国最权威的内质网绿色荧光探针（活细胞）试剂销售服务商之一，在浦东新区等地方销售内质网绿色荧光探针（活细胞）试剂已经多年。生物在线为您提供众多企业内质网绿色荧光探针（活细胞）仪器产品及图片，以便挑选到性价比高，合适的内质网绿色荧光探针（活细胞）产品 查看更多
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商品咨询
请问哪里能买到一些药品的标准品?123
狼人聪2021-08-09
检所买自制单位要检查用或者溯源性要求检所没都外面公司其实代售些单位给您购买省您家单位跑疑问问我北京捷诚科远化工技术研究院您服务与想要产品
请问一下巨噬细胞M1 M2 marker的选择 免疫学讨论版 专业医生...123
突金塔62017-06-03
没有标准品怎么测纯度 分析技术讨论版123
最爱熊丸子2021-08-08
我做实验的药物很难买到标准品，但现在有粗品，自己在提纯，想问下各位大牛，在没有标准品的情况下，怎么测提纯后该物质的纯度。谢谢
RNA干扰的详细实验步骤_实验方法_123
小森尔2017-11-07
siRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。RNA干扰主体实验的重点在于： 按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：⒈转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）
什么是标准品CRM和对照品RM123
暮晨爱小念xf52017-10-12
Certified Reference Materials (CRM)
Reference material, accompanied by a certificate, one or more of whose property values are certified by a procedure, which established its traceability to an accurate realization of the unit in which the property values are expressed, and for which each certified value is accompanied by an uncertainty at a stated level of confidence. (Brammer StandardBASARMIetc). (ISO Guide 30-1992)
标准品CRM：标准物质/标准品附带析证书属性值某项或若干项都按照某程序进行验证验证程序建立些属性值所表述体系精确体现追溯性每经验证数值都伴随着某特定置信水平确定度（BS,NISTBASARMI等）（ISO Guide 30-1992）
Reference Materials（RM）
Materials or substance one or more of whose property values are sufficiently homogeneous and well established to be used for the calibration of an apparatus, the assessment of a measurement method, or for assigning values to materials. （ISO Guide 30-1992）
照品RM：种原料或物质其某种或几种属性值表现充均性并且用于设备校准析评估或者物质定植（ISO Guide 30-1992）
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Reference Materials（RM）
Materials or substance one or more of whose property values are sufficiently homogeneous and well established to be used for the calibration of an apparatus, the assessment of a measurement method, or for assigning values to materials. （ISO Guide 30-1992）
照品RM：种原料或物质其某种或几种属性值表现充均性并且用于设备校准析评估或者物质定植（ISO Guide 30-1992）
酪氨酸酶抑制剂快速筛选方法的建立 中国知网 123
zjs123092012-04-06
本人最近在做中药里酪氨酸酶抑制剂的筛选，存在一些疑惑，望大家帮忙解答。
1、测定酶比活力：底物需要过量么？测定时间多长？是否可以加入过量的底物，然后测定3min吸光度的增加值，从吸光度的变化值计算比活力。
2、在酶抑制剂筛选的过程中，是否需要保证底物过量？还是要水浴一定时间让反应完全？我看到文献说用终浓度为0.1μmol/mL的底物，终浓度为45U/ml的酶，我想问，假设总体积为1ml，那么终浓度为45U/ml的酶岂不是每分钟能转化4.8μmol的底物？那么0.1μmol/mL的底物不就几秒钟就反应完了？那么怎么测定初速度？
1、测定酶比活力：底物需要过量么？测定时间多长？是否可以加入过量的底物，然后测定3min吸光度的增加值，从吸光度的变化值计算比活力。
2、在酶抑制剂筛选的过程中，是否需要保证底物过量？还是要水浴一定时间让反应完全？我看到文献说用终浓度为0.1μmol/mL的底物，终浓度为45U/ml的酶，我想问，假设总体积为1ml，那么终浓度为45U/ml的酶岂不是每分钟能转化4.8μmol的底物？那么0.1μmol/mL的底物不就几秒钟就反应完了？那么怎么测定初速度？
PCV的感染性克隆载体构建 分子生物 综合其他 论坛...123
小锋01742021-08-16
cDNA克隆mRNA原材料,经体外反转录合互补DNA(cDNA),再与载体DNA连接引入寄主细胞.每cDNA反映种mRNA结构,cDNA克隆布反映mRNA布.特点：
①些物,RNA病毒没DNA,能用cDNA克隆；
②cDNA克隆易筛选,cDNA库包含非结构基克隆,且每cDNA克隆含mRNA信息；
③cDNA能细菌表达.cDNA仅代表某发育阶段表达遗传信息,基文库才包含物完整遗传信息.
①些物,RNA病毒没DNA,能用cDNA克隆；
②cDNA克隆易筛选,cDNA库包含非结构基克隆,且每cDNA克隆含mRNA信息；
③cDNA能细菌表达.cDNA仅代表某发育阶段表达遗传信息,基文库才包含物完整遗传信息.
什么是内部标准品无官方对照品时,想把原料标定为对照 123
刘德杰安飞2017-11-14
官照品想原料标定照品标定
外泌体(Exosome)知识与检测方法MedSci.cn123
叫阿呆好了2016-06-12
这个PPT是故障的，里面内容不全，大家不要下载，请大家和版主说让他把这篇帖子删除我重新再发
外泌体提取与鉴定.pptx(2895.91k)
病毒诱导基因沉默123
2021-07-25
VIGS病毒诱导的基因沉默。原理都是一样的，只不过是利用病毒诱导的RNA干扰。病毒做为载体（插入你靶基因的片段）去侵染寄主，引起靶基因沉默。
外泌体表面蛋白怎么进行定量,比如CD63,怎么样对外泌体进行定量...123
a大胖子2017-11-29
请教各位大神，大家知道怎样对外泌体表面蛋白进行定量吗？看有文献用Western，还有裂解外泌体后用BCA进行定量，请问裂解后的外泌体蛋白定量应该是外泌体全部蛋白的吧，应该不只是表面蛋白（CD63这种）吧，还有这个BCA是怎么操作呢？有没有很可靠地能表示外泌体表面蛋白的定量方法？另外，怎么根据外泌体表面蛋白的量来算出外泌体的量呢？还有外泌体文献报道的外泌体浓度为μg/ml,这种浓度是怎样测出来的呢？还有表示外泌体10^9/ml这个测外泌体个数的应该是通过NTA吧？求大神分享外泌体定量的方法？急急急~
建立cdna文库时cdna的合成条件123
双鱼座o862021-08-08
cDNA双链合成
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2. cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成
oligo(dT)引导的DNA合成法:
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成
第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
自身引导法合成双链cDNA 原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3,引物-衔接头法
1. Superscipt II—RT合成第一链:
1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入
xul mRNA(大约500ng)
1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)
(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)
11-x ul RNase-free water
（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）
2. 混匀后,70℃反应10分钟;
3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;
4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:
4ul 5×first strand buffer
2ul 0.1M DTT
1ul 10mM dNTP(自己配制)
5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;
7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.
2. cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):
20ul 10×DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP(自己配制)
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后,16℃反应2.5小时;
3. 70℃灭活10分钟;
4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;
5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平
1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):
6ul 10mM dNTP
2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)
2ul BSA(10mg/ml)
2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;
4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;
5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;
6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;
7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;
8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.
注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
PCR纯化试剂盒操作流程：
1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。
2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。
3．加入spin column中，13000rpm离心1min。
4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。
5．13000rpm，再离心1min。
6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。
7．13000rpm离心2min。
8．加入30ul buffer EB，静置10min。
9．13000rpm离心2min。
10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
4 EcoR I adaptor 加接
1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;
2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:
1.2ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)
3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;
5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切
1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;
2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:
1ul 10×Ligase Buffer
1ul 10mM rATP
6ul dd H2O
1ul T4 PNK(10U/ul)
3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;
4. 稍微离心使反应物集中至管底;
5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:
4ul Xho 10×Buffer
2ul BSA
5ul ddH2O
8ul Xho I (10U/ul)
6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;
7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。
6.胶回收cDNA
1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶
2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。
3．电泳50V；1hr
4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。
5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）
6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII
7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮
8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）
9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬
10． 离心并去上清（同操作8）
11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清
12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清
13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。
14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。
15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。
注意事项：
1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。
2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成
oligo(dT)引导的DNA合成法:
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.
缺 陷:
因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始. 第二链的合成
第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.
缺 点:
在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.
自身引导法合成双链cDNA 原 理:
以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
优点:a)合成cDNA的效率高
b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化
c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
3,引物-衔接头法
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