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2018-12-26
北京义翘神州科技有限公司(Sino Biological Inc.)在发布的大鼠 DTYMK 基因 ORF cDNA clone (克隆载体)供应信息，浏览与大鼠 DTYMK 基因 ORF cDNA clone (克隆载体)相关的产品或在搜索更多与大鼠 DTYMK 基因 ORF cDNA clone (克隆载体)相关的内容。 查看更多
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2021-09-17
化 学 调 控 靶 基 因 转 录 的 方 法 有 很 多 种 ，最 常 见 的 是 利 用 影 响 转 录 因 子 活 性 的 别 构 调节 物 进 行 调 控 。其 中 的 一 个 方 法 是 运 用 二 聚 化 的 诱 导 剂 或 者 二 聚 体 在 无 活 性 的 融 合 蛋 白上 重 组 有 活 性 的 转 录 因 子 。最 常 用 的 体 系 是 将 天 然 产 物 雷 帕 霉 素 （r a p a m y d n ) 或 者 无生物 活 性 的 类 似 物 作 为 二 聚 化 的 药 物 。 查看更多
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2021-08-17
· Yeast Two-Hybrid System (Finley Lab)This is one of the most comprehensive and detailed guide to yeast two-hybrid system te 查看更多
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2021-07-22
蝙蝠腺病毒复制过程中基因表达动态分布近期，中科院武汉病毒所石正丽研究员领导的科研团队采用第二代高通量测序技术，对蝙蝠腺病毒BtAdV-TJM感染蝙蝠细胞系的转录谱做了系统的分析，提供了一套完整的蝙蝠腺病毒复制过程中病毒基因表达的动态分布。结 查看更多
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2021-08-02
多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性 成单链作模板，然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物，引物分别与待扩增DNA片段的两端互补，经55℃ 低温退火，引物与模板互补结合。在72℃条件下，结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反应体系中的4种dNTP为原料，按碱基互补配对的方式 延伸合成两条新的DNA链。所扩增的DNA可作为下一轮扩增反应的模板。重复 查看更多
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酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 。典型的真核生物转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域： DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激... 查看更多
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2021-06-03
Cisbio 利用其专利 HTRF 技术，研发了适用于基础科研、初筛、复筛的 Biomarker 检测解决方案，主要的应用分为以下几方面。 1. 炎症研究 2. 代谢疾病研究 3. cGMP 的测定 4. 其他可代替 ELISA 的 Biomarker 检测试剂盒 Biomarker 试剂盒的特点 ●可替代 ELISA ●操作简单，试验耗时少 ●一般无需洗涤过程，更适合自动化筛选 ●能微缩试验系统体积（特定情况下，最少可至 10ul 以下） ●有多 查看更多
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2021-08-27
最近，来自美国奥古斯塔大学佐治亚医学院病理系的研究人员发现GT198基因突变或可成为乳腺癌早期诊断和治疗的新靶向目标。 早先研究发现该基因发生的突变主要出现在早发乳腺癌和卵巢癌。现在科学家们证明帮助形成健康乳腺组织的干细胞或祖细胞也会存在GT198基因突变，并为乳腺癌的发生提供一个绝佳的“温床”。 相关研究结果发表在国际学术期刊American Journal of Pathology上，该研究共包含254例绝经前和绝经后的乳腺癌患... 查看更多
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2021-09-07
多元实时 PCR 时，在一个反应管中加入不同标记的成对引物，从而可以同时分析多个不同的基因。在许多反应中，用 JOE 标记看家基因对模板定量，用 FAM 标记目的基因,证明 LUX 引物非常有效。在标准的多元体系中，使用的引物浓度和加入的体积与进行一元反应时相同，如下。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。 查看更多
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2021-08-10
反转录 PCR ( reversetranscriptase'PCR，RT-PCR ) 是一种从 RNA 扩增 cDNA 拷贝的方法。RT-PCR 对于获得与克隆 mRNA 的5'、3' 末端序列和从非常少量的 mRNA 样品构建大容量的 cDNA 文库方面都是极为灵敏与通用的方法。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。 查看更多
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2019-03-20
我要做酵母双杂交，有战友在做吗，交流一下，我的QQ446357706，现在我先把我的资料给大家看看吧，我自己写的程序酵母培养：YPD: 蛋白胨20g ,酵母提取物10g ,琼脂20g葡萄糖20g或灭菌后加入葡萄糖（40% 50ml；过滤除菌/121℃,15min）,使终浓度为2%.YPDA: YPD+adenin hemisulfate(0.2% 15ml;对热不稳定，不能高温高压灭菌)，使终浓度为0.003%.SD /:（SD /完全，SD /-./././.）无氨基酸酵母 ... 查看更多
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基因突变和基因变异的区别123
兮兮光砐1h2017-10-02
基突变
gene mutation
由于DNA发碱基增添、缺失或改变,引起基结构改变,叫做基突变.
1基内部遗传结构改变 .称点突变,通引起定表型变化 .广义突变包括染色体畸变.狭义突变专指点突变.实际畸变点突变界限并明确,特别微细畸变更.野型基通突变突变型基.突变型词既指突变基,指具突变基体.
基突变通发DNA复制期,即细胞裂间期,包括丝裂间期减数裂间期；同基突变脱氧核糖核酸复制、DNA损伤修复、癌变衰都关系,基突变物进化重要素,所研究基突变除本身理论意义外广泛物意义.基突变遗传研究提供突变型,育种工作提供素材,所科研究产实际意义.
基变异 基变异指基组DNA发突遗传变异.水平看,基变异指基结构发碱基组或排列顺序改变.基虽十稳定,能细胞裂精确复制自,种隐定性相.
定条件基原存形式突改变另种新存形式,位点,突现新基,代替原基,基叫做变异基.于代表现突现祖先未新性状.
gene mutation
由于DNA发碱基增添、缺失或改变,引起基结构改变,叫做基突变.
1基内部遗传结构改变 .称点突变,通引起定表型变化 .广义突变包括染色体畸变.狭义突变专指点突变.实际畸变点突变界限并明确,特别微细畸变更.野型基通突变突变型基.突变型词既指突变基,指具突变基体.
基突变通发DNA复制期,即细胞裂间期,包括丝裂间期减数裂间期；同基突变脱氧核糖核酸复制、DNA损伤修复、癌变衰都关系,基突变物进化重要素,所研究基突变除本身理论意义外广泛物意义.基突变遗传研究提供突变型,育种工作提供素材,所科研究产实际意义.
基变异 基变异指基组DNA发突遗传变异.水平看,基变异指基结构发碱基组或排列顺序改变.基虽十稳定,能细胞裂精确复制自,种隐定性相.
定条件基原存形式突改变另种新存形式,位点,突现新基,代替原基,基叫做变异基.于代表现突现祖先未新性状.
请问如何下载肝癌和癌旁组织的转录谱和表达谱,并对特定蛋白的差异...123
tommyhechina2017-01-21
最近导师要求做一个关于PARP家族蛋白在肝癌和癌旁组织中转录以及表达情况的初步研究，以确定目前的课题是否有很大价值。我之前一直在做湿实验，没有生信背景，所以对这个工作比较头疼。我不会编程，所以直接上网查找有没有可以在网上直接进行分析的网站。我一开始是上cbioportal上对肝癌的mRNA转录谱进行分析，但网站里面提供的对照是一个所谓的标准正常人。我没查到这个所谓的标准正常人是什么，而且导师说肝癌可能存在个体差异，所以要求用肝癌及其对应的癌旁组织的转录谱和表达谱进行分析。我上GEO搜索癌旁组织（paracanceroustissue），根本什么想要的结果都没有。我现在完全是一头雾水，无从下手，希望有做相关领域工作的前辈们或是做与之类似的工作的前辈们提供指导，非常感谢！
暑假作业(7)基因突变及其他变异高一下学期生物人教版必修二.doc...123
徐涛_yanlnl2017-11-10
按照表型效应突变型区形态突变型、化突变型及致死突变型等区并涉及突变本质且严格形态突变致死突变必物化基础所严格讲切突变型都物化突变型
1.形态突变：结构镰刀型细胞贫血症；体水平红眼突变白眼
2.化突变：镰刀型细胞贫血症血红蛋白结构突变原理
3.致死突变：比隐性纯合致死
1.形态突变：结构镰刀型细胞贫血症；体水平红眼突变白眼
2.化突变：镰刀型细胞贫血症血红蛋白结构突变原理
3.致死突变：比隐性纯合致死
胱抑素C测定试剂盒怎么用,注意事项123
放弃愛情LRqk12017-11-10
胱抑素C检测试剂盒(干式免疫荧光定量)内含10条、25条、50条或100条单份检测卡每份试剂由检测卡干燥剂构检测卡由试纸条外壳试纸条构其试纸条由品垫、层析膜(检测区包CysC单克隆抗体I作捕获抗体质控区包兔抗鼠IgG抗体NC膜缘与品垫交界处包荧光标记CysC单克隆抗体II)、吸水纸、衬垫构检测缓冲液10管/盒25管/盒50管/盒100管/盒四种规格含吐温20、叠氮钠防腐剂等磷酸盐缓冲液pH=7.2±0.2基本参数：线性范围：0.50mg/L～10.00mg/L范围内线性相关系数r≥0.990准确度：相关系数r≥0.975相偏差≤20%批内重复性：应≤10%批间差：应≤15%
怎样查一个蛋白的受体123
红颜17272017-10-02
、酵母双杂交系统：酵母双杂交系统前广泛用于蛋白质相互作用组研究种重要其原理靶蛋白诱饵蛋白特异结合诱饵蛋白结合于报道基启启报道基酵母细胞内表达检测报道基表达产物则说明两者间相互作用反则两者间没相互作用种技术微量化、阵列化则用于规模蛋白质间相互作用研究实际工作根据需要发展单杂交系统、三杂交系统反向杂交系统等Angermayr等设计SOS蛋白介导双杂交系统研究膜蛋白功能丰富酵母双杂交系统功能外酵母双杂交系统作用已扩展至蛋白质鉴定
二、噬菌体展示技术：编码噬菌体外壳蛋白基连接单克隆抗体DNA序列噬菌体表面表达相应单抗再噬菌体柱柱若含目蛋白与相应抗体特异性结合称噬菌体展示技术技术主要用于研究蛋白质间相互作用仅高通量及简便特点具直接基、高选择性筛选复杂混合物、筛选程通适改变条件直接评价相互结合特异性等优点目前用优化噬菌体展示技术已经展示鼠两种特殊细胞系cdna文库并离皮信号传导途径信号
三、等离共振技术：表面等离共振技术(Surface Plasmon ResonanceSPR)已蛋白质相互作用研究新手段原理利用种纳米级薄膜吸附诱饵蛋白待测蛋白与诱饵蛋白结合薄膜共振性质发改变通检测便知两种蛋白结合情况SPR技术优点需标记物或染料反应程实监控测定快速且安全用于检测蛋白核酸及其物间相互作用
四、荧光能量转移技术：荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究间距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合定量获取关物体内蛋白质、脂类、DNA RNA 空信息随着绿色荧光蛋白(GFP)发展FRET 荧光显微镜能实测量体细胞内态性质提种定量测量FRET效率及供体与受体间距离简单仅需使用组滤光片测量比值利用供体受体发射谱消除光谱间串扰该简单快速实定量测量FRET 效率供体与受体间距离尤其适用于基于GFP 供体受体
五、抗体与蛋白质阵列技术：蛋白芯片技术现给蛋白质组研究带新思路蛋白质组研究主要内容研究同理状态蛋白水平量变微型化集化高通量化抗体芯片非研究工具芯片发展快芯片且技术已经益熟些抗体芯片已经向临床应用发展比肿瘤标志物抗体芯片等已经应用再眼各领域
六、免疫共沉淀技术：免疫共沉淀主要用研究蛋白质与蛋白质相互作用种技术其基本原理细胞裂解液加入抗兴趣蛋白抗体孵育再加入与抗体特异结合结合于Pansobin珠金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)若细胞与兴趣蛋白结合目蛋白形种复合物：目蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA|PansobinSPA|Pansobin比较复合物离离经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳复合物四组经Western blotting用抗体检测目蛋白否预测蛋白种目蛋白细胞内与兴趣蛋白结合符合体内实际情况蛋白信度高种两缺陷：两种蛋白质结合能直接结合能第三者间起桥梁作用;二必须实验前预测目蛋白选择检测抗体所若预测确实验结本身具冒险性
七、pull-down技术：蛋白质相互作用类型牢固型相互作用暂型相互作用两种牢固型相互作用亚基蛋白复合体见通免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western研究Pull-down技术用固相化、已标记饵蛋白或标签蛋白(物素-、PolyHis-或GST-)细胞裂解液钓与相互作用蛋白通Pull-down技术确定已知蛋白与钓蛋白或已纯化相关蛋白间相互作用关系体外传路或翻译体系检测蛋白相互作用关系
二、噬菌体展示技术：编码噬菌体外壳蛋白基连接单克隆抗体DNA序列噬菌体表面表达相应单抗再噬菌体柱柱若含目蛋白与相应抗体特异性结合称噬菌体展示技术技术主要用于研究蛋白质间相互作用仅高通量及简便特点具直接基、高选择性筛选复杂混合物、筛选程通适改变条件直接评价相互结合特异性等优点目前用优化噬菌体展示技术已经展示鼠两种特殊细胞系cdna文库并离皮信号传导途径信号
三、等离共振技术：表面等离共振技术(Surface Plasmon ResonanceSPR)已蛋白质相互作用研究新手段原理利用种纳米级薄膜吸附诱饵蛋白待测蛋白与诱饵蛋白结合薄膜共振性质发改变通检测便知两种蛋白结合情况SPR技术优点需标记物或染料反应程实监控测定快速且安全用于检测蛋白核酸及其物间相互作用
四、荧光能量转移技术：荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究间距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合定量获取关物体内蛋白质、脂类、DNA RNA 空信息随着绿色荧光蛋白(GFP)发展FRET 荧光显微镜能实测量体细胞内态性质提种定量测量FRET效率及供体与受体间距离简单仅需使用组滤光片测量比值利用供体受体发射谱消除光谱间串扰该简单快速实定量测量FRET 效率供体与受体间距离尤其适用于基于GFP 供体受体
五、抗体与蛋白质阵列技术：蛋白芯片技术现给蛋白质组研究带新思路蛋白质组研究主要内容研究同理状态蛋白水平量变微型化集化高通量化抗体芯片非研究工具芯片发展快芯片且技术已经益熟些抗体芯片已经向临床应用发展比肿瘤标志物抗体芯片等已经应用再眼各领域
六、免疫共沉淀技术：免疫共沉淀主要用研究蛋白质与蛋白质相互作用种技术其基本原理细胞裂解液加入抗兴趣蛋白抗体孵育再加入与抗体特异结合结合于Pansobin珠金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)若细胞与兴趣蛋白结合目蛋白形种复合物：目蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA|PansobinSPA|Pansobin比较复合物离离经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳复合物四组经Western blotting用抗体检测目蛋白否预测蛋白种目蛋白细胞内与兴趣蛋白结合符合体内实际情况蛋白信度高种两缺陷：两种蛋白质结合能直接结合能第三者间起桥梁作用;二必须实验前预测目蛋白选择检测抗体所若预测确实验结本身具冒险性
七、pull-down技术：蛋白质相互作用类型牢固型相互作用暂型相互作用两种牢固型相互作用亚基蛋白复合体见通免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western研究Pull-down技术用固相化、已标记饵蛋白或标签蛋白(物素-、PolyHis-或GST-)细胞裂解液钓与相互作用蛋白通Pull-down技术确定已知蛋白与钓蛋白或已纯化相关蛋白间相互作用关系体外传路或翻译体系检测蛋白相互作用关系
生物体内的基因突变都属于可遗传的变异这句话对吗 微思作业本123
闽闽加油2017-12-02
任何基因突变都是生化突变这句话不对。生化突变型 （biochemical mutant ）由于基因突变，参与代谢系的酶的活性降低或缺失，这突变型称生化突变型。
其突变性状可用生化的方法鉴别，与可见的形态突变型迥然有别。代表性的例子如与氨基酸、维生素、核酸碱基等合成代谢有关的酶失活的营养突变型，以及呼吸突变型、抗药突变型等。它们不仅广泛用于遗传学分析，而且还用于活体内代谢途径的研究和物质的生物测定等。还有许多未知用途。
基因突变可以是自发的也可以是诱发的。自发产生的基因突变型和诱发产生的基因突变型之间没有本质上的不同，基因突变诱变剂的作用也只是提高了基因的突变率。
按照表型效应，突变型可以区分为形态突变型、生化突变型以及致死突变型等。这样的区分并不涉及突变的本质，而且也不严格。因为形态的突变和致死的突变必然有它们的生物化学基础，所以严格地讲一切突变型都是生物化学突变型。根据碱基变化的情况，基因突变一般可分为碱基置换突变（base substitution和移码突变（frameshift mutation）两大类。
其突变性状可用生化的方法鉴别，与可见的形态突变型迥然有别。代表性的例子如与氨基酸、维生素、核酸碱基等合成代谢有关的酶失活的营养突变型，以及呼吸突变型、抗药突变型等。它们不仅广泛用于遗传学分析，而且还用于活体内代谢途径的研究和物质的生物测定等。还有许多未知用途。
基因突变可以是自发的也可以是诱发的。自发产生的基因突变型和诱发产生的基因突变型之间没有本质上的不同，基因突变诱变剂的作用也只是提高了基因的突变率。
按照表型效应，突变型可以区分为形态突变型、生化突变型以及致死突变型等。这样的区分并不涉及突变的本质，而且也不严格。因为形态的突变和致死的突变必然有它们的生物化学基础，所以严格地讲一切突变型都是生物化学突变型。根据碱基变化的情况，基因突变一般可分为碱基置换突变（base substitution和移码突变（frameshift mutation）两大类。
...Biotech”为您提供“全能型酵母双杂交系统和蛋白表达系统123
djyuanm2021-08-15
大家做膜蛋白双杂交用那家公司的系统？很急
用酵母双杂交或是细菌双杂交？
用酵母双杂交或是细菌双杂交？
人白细胞介素10(hIL10)cDNA克隆与表达的研究123
安诺瑞康2021-09-13
白细胞介素10（IL-10）是一种由多种细胞亚群产生的重要免疫调节因子。
早期研究显示，其主要生物功能为限制炎症反应及调节多种免疫细胞的分化和增殖，例如：T细胞、B细胞、NK细胞、
抗原呈递细胞、肥大细胞、粒细胞等。近来研究结果提示，IL-10也可以介导免疫反应的激活，有助于清除感染及非感染
颗粒且只产生轻微的炎症反应。大量的研究，包括患者IL-10的表达分析、体外实验及动物实验表明，IL-10与自身免疫
性疾病、炎症、肿瘤等疾病的发生、发展关系密切。临床试验主要集中于RA、炎症性肠病、银屑病、器官移植和丙型肝
炎等。虽然试验结果各不相同，但是使我们对IL-10在免疫反应中的作用的认识更加深入，同时也预示IL-10可以成为一
种治疗药物。目前，我国还没有重组基因工程IL-10药物上市，而且在探索如何高效表达具有生物活性rhIL-10的研究尚
处于起步阶段。本研究建立在国内外IL-10重组基因工程研究基础上，拟克隆人IL-10基因，通过原核、真核两种表达系
统表达IL-10蛋白，奠定重组基因工程研制人IL-10的基础。主要研究结果如下：一、依据Genbank中人类IL-10序列设计
一对特异性引物，应用RT-PCR技术，从LPS刺激的外周血单个核细胞中成功地克隆出hIL-10成熟肽编码序列，并将之克
隆入pGEM-T载体，构建出中间载体<WP=91>pGEM-T-hIL-10，转化入大肠杆菌JM109中，经酶切鉴定及序列测定与
分析，与GenBank中发表的（NM000572.2）hIL-10成熟肽编码序列完全一致。为hIL-10基因的表达研究奠定了基
础。二、从中间载体pGEM-T-hIL-10中将hIL-10成熟肽编码序列酶切回收，定向克隆至原核表达载体pET-28a(+)的T7
启动子下游，成功地构建了原核表达载体pET-28a(+)-hIL-10，将表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLyss中获得表达
菌株，经IPTG的诱导获得较高表达，表达蛋白以包涵体形式存在。经薄层扫描确定目的蛋白表达量占菌体总蛋白的
28.7%。Westernblotting分析结果显示，表达产物与抗hIL-10单克隆抗体呈特异性阳性反应。产物经固相金属离子亲
和层析方法初步纯化，并在柱上应用浓度递减的尿素缓冲液对产物进行复性。活性研究结果表明，复性产物具有抑制
LPS刺激的外周血单核细胞表达MHCⅡ分子的活性。三、为了进一步获得高活性、高表达、适用于产业化生产的rhIL-
10，本研究选择应用酵母表达系统对hIL-10进行表达。应用PCR方法从pGEM-T-hIL-10扩增出hIL-10成熟肽编码序
列，并在其上下游分别引入EcoRI和BaxⅠ两个酶切位点，通过定向克隆成功地构建出分泌型酵母表达载体pPICZαA-
rhIL-10。采用电穿孔技术将表达单位转化入酵母菌P.pastorisX-33中，通过提取酵母基因组进行PCR鉴定以及
MD/MM营养表型筛选，初步筛选出10株可表达具有hIL-10活性的酵母菌。小量发酵培养表达菌株，以0.5%甲醇诱导
96小时，培养上清中蛋白经硫酸铵沉淀后，经SDS-PAGE、薄层扫描显示rhIL-10约占样品蛋白总量的10%。产物经固
相金属离子亲和层析方法初步纯化，纯度达94%。活性研究结果显示酵母表达的分泌型rhIL-10具有较原核表达产物更高
的活性。
【求助】关于RNA干扰技术的问题 核酸基因技术123
whitley2021-08-09
各位大侠，俺正在准备用雪旺细胞做RNA干扰，但俺是个菜鸟，对此技术以及质粒克隆技术一窍不通，俺看了些资料，有些问题不太明白，请各位大侠不吝赐教：
1、RNA干扰基因蛋白的表达的过程是瞬间的还是一步步的，需要一段时间才能使目的基因沉默。
2、关于siRNA的合成，有好多种，但文献报道的一般是化学合成的和通过构建质粒表达载体完成的，但据俺了解，体外转录和RNA酶III酶切从时间上和价格上都比这两种方法好，为何这么多研究者青睐这两种方法呢
3、俺打算用此方法研究某个基因的功能，想先进行体外实验，然后再进行在体实验，请教各位，用哪种方法比较好？
4、如果用质粒的话，究竟用哪种质粒好呢？听说质粒比较昂贵，看到好多文献所用质粒都是惠赠的，怎么才能通过惠赠的方式获得质粒载体呢
或许俺提的这些问题过于低级，恳切希望各位高手予以解答，不才万分感激！
1、RNA干扰基因蛋白的表达的过程是瞬间的还是一步步的，需要一段时间才能使目的基因沉默。
2、关于siRNA的合成，有好多种，但文献报道的一般是化学合成的和通过构建质粒表达载体完成的，但据俺了解，体外转录和RNA酶III酶切从时间上和价格上都比这两种方法好，为何这么多研究者青睐这两种方法呢
3、俺打算用此方法研究某个基因的功能，想先进行体外实验，然后再进行在体实验，请教各位，用哪种方法比较好？
4、如果用质粒的话，究竟用哪种质粒好呢？听说质粒比较昂贵，看到好多文献所用质粒都是惠赠的，怎么才能通过惠赠的方式获得质粒载体呢
或许俺提的这些问题过于低级，恳切希望各位高手予以解答，不才万分感激！
由cDNA全长怎么得到DNA全长? 分子生物 PCR相关 论坛...123
liuhua2021-09-05
mRNA模板经反转录酶催化体外反转录cDNA步骤应该与DNA复制程类似需要原料mRNA模板四脱氧核糖核苷酸逆转录酶能量注意：获DNA片段含非编码区序列专业答).构建cDNA文库：物细胞总mRNA模板用反转录酶合互补双链cDNA接载体转入宿主建立基文库cDNA文库1、mRNA提取及其完整性确定1）总RNA提取RNA提取：APGC或NP-40或应用试剂盒提取总RNA2）mRNA离高等真核物mRNA3'端均poly(A)尾总RNA通寡聚（DT）纤维柱离mRNA或利用磁珠制备纯mRNA某些情况裂解细胞用蔗糖梯度制备mRNA-核糖体复合物作提取mRNA替换途径3）mRNA纯化①按照总mRNA进行级主要用琼脂糖凝胶电泳蔗糖密度梯度离进行级；②聚核糖体免疫纯化利用抗体纯化合目肽4）mRNA完整性确定确定mRNA完整性三种：①直接检测mRNA；②测定mRNA转译能力；③检测总mRNA指导合cDNA第链能力2、cDNA合克隆1）cDNA第链合用亲层析mRNA根据mRNA3'端poly(A)尾结构原理用12~20核苷酸oligo（dT）与纯化mRNA混合oligo（dT）与poly(A)结合作反转录酶引物反转录反应产物条RNA-DNA杂交链oligo（dT）结合mRNA3'端合全cDNA需要反转录酶mRNA端移另端种全合难达尤其mRNA链建立种随机引物合cDNA随机引物种度6~10核苷酸由4种碱基随机组DNA片段与oligo（dT）仅与mRNA3'端结合同mRNA同位点结合随机引物合产物RNA-DNA杂交体cDNA克隆载体前必须种杂交体RNA转变DNA链即形双链DNA2）.双链cDNA合合cDNA第二条链两种种利用cDNA第链3'末端现发夹环特征种发夹结构反转录酶第链末端返折并且进行复制第链结合cDNA第二链提供用引物用种合双链cDNA端发夹环用单链特异S1核酸酶切S1核酸酶处理修剪cDNA顺序使cDNA丢失mRNA5'端部顺序另种用肠杆菌RNaseH进行修饰RNaseH能识别RNA-DNA杂交并其RNA切割短片段些RNA短片段仍与cDNA第链结合新合DNA所取代新合DNA存切口用DNA连接酶些切口连接起形条完整DNA链RNaseH优于S1核酸酶能获包括mRNA5'端全部或绝部更顺序cDNA3）cDNA重组载体合cDNA与载体DNA进行连接般3种：①借助于末端转移酶3'-OH端合均聚物能力双链cDNA线性化载体DNA3'-OH端别加均聚核苷酸链；②双链cDNA线性化载体DNA别用Klenow片段进行末端补平用T4DNA连接酶进行齐连接形重组体；③通粘性末端连接4）.转化重组载体DNA定条件转化入肠杆菌形携带质粒菌株同重组DNA含同cDNA基整转化含自mRNA群体各种cDNA基转化群体构该mRNA全部遗传信息cDNA基文库5）.目cDNA克隆鉴定用于cDNA文库筛选鉴定目cDNA主要3种：①核酸杂交②免疫杂交检测③cDNA同胞选择
关于克隆的优缺点请说明优或缺点,并说明理由,_123
zjz7892021-08-22
用
【求助】GFP转染的一些问题 细胞技术讨论版论坛123
chedoctor2014-01-29
用带GFP的干扰质粒转染细胞，转染后24小时看荧光，转染效约30%左右，然后消化铺板，铺板后30小时的样子加G418筛选，筛选到第5天看，可看到散在发荧光的细胞，但等到14天筛选完毕，克隆已形成，细胞看不到一点荧光，是怎么回事啊？我筛选出来的是不是真正的阳性克隆啊？请有经验的高手解答，多谢！
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