各位大侠：
大家好，小弟最近做做乙脑病毒（JEV）全长感染性克隆，实验遇到一些问题，希望得到园子里面高手的指点。乙脑为单股正链RNA病毒，病毒基因组全长约为11kb，小弟以takarapMD19-TsimpleT载体（该载体来源PUC载体系列，含有PUCori，2700bp）为模板，为了克隆乙脑全长CDNA，将JEV全长基因组分四段进行RT-PCR扩增，得到JEV-A（2.2kb）,JEV-B（3.5kb）,JEV-C（3.3kb）,JEV-D（1.9kb）四个片段，JEV-***段5.端加上了T7启动子为后面进行体外转录用，在克隆前对宝生物的pMD19-TsimpleT载体进行了改造，连了一段linker序列（500bp左右），该序列中含有克隆JEV四段序列的单一酶切位点（克隆过程中的酶切位点均为常见酶，排除未切开的可能性，而且每次酶切均发现有小片段被切下）。采用分四段分部克隆的策略将乙脑病毒全长基因组连上改造后的载体。JEV-A很顺利一次连上，再连JEV-D也很顺利也一次连上，再连JEV-C，连了很多次，用了TAKARAT4，solutionI和NEB的连接酶均为能连上，也调整了DNA和载体的比例均未能连上，是不是PUC系列载体容量有限，装不下太大的片段，载体上连上的片段加起来越大了往上面再连就越困难。问了宝生物的客服说PUC载体最大能容下18kb的片段。之前也将JEV基因组分两段进行克隆，每段5000多bp，连了很多次一段都没连上去，故将全长DNA分四段，想每次往上面连一部分，每连上一段载体相当于变成了一个新载体，载体大小也变大了，能插入的片段也会相应变大。另外，实验室另一个学生拿pbluescriptsk载体（3.0kb）来连，采用类似的克隆策略均为连上，大家觉得是什么原因，是不是得换载体，换大载体，我查了很多别人也有拿pbluescriptsk载体建其他病毒感染性克隆的也能连上（都是连10kb以上的片段），到底是哪个环节出问题已经做了一个暑假2个多月均未得到克隆，急死了，请大家给点高见。
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