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【旧帖整理】miRNA、siRNA、RNA干扰原理,步骤及相关问题总结!有问题的也可以提,共同交流讨论![精华]
2018-01-22
问题描述:

RNA干扰(RNAi):近年来的研究表明,将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性的降解,导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被称为RNA干扰(RNAi)。

MicroRNA(miRNA,微RNA):即为长度为22nt左右的5′端带磷酸基团、3′端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。

小的干涉RNA(siRNA):是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA,由约20个碱基对组成,包括5个磷酸盐,2个核苷和3个悬臂。

miRNA与siRNA之间有许多相同之处:1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工,是Dicer的产物,所以具有Dicer产物的特点。3.二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。4.二者都是RISC组分,所以其功能界限变得不清晰,如二者在介导沉默机制上有重叠。5.miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。

miRNA与siRNA的不同点:1.根本区别是miRNA是内源的,是生物体的固有因素;而siRNA是人工体外合成的,通过转染进入人体内,是RNA干涉的中间产物。2.结构上,miRNA是单链RNA,而siRNA是双链RNA。3.Dicer酶对二者的加工过程不同,miRNA是不对称加工,miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂,其他部分降解;而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。4.在作用位置上,miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区,而siRNA可作用于mRNA的任何部位。5.在作用方式上,miRNA可抑制靶标基因的翻译,也可以导致靶标基因降解,即在转录水平后和翻译水平起作用,而siRNA只能导致靶标基因的降解,即为转录水平后调控。6.miRNA主要在发育过程中起作用,调节内源基因表达,而siRNA不参与生物生长,是RNAi的产物,原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

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tmxk1fwow
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4. siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。
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xiaoyu0319
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谢谢楼主
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liuzeyi2002
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补充点!首先外源性或细胞内源性的dsRNA与胞内的RNAi核酸酶(如Dicer)相结合,之后dsRNA被RNAi核酸酶切割成21~23nt的小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA),此siRNA含有2~3nt的3′突出端,被输送到RISC(RNA-in-ducedsilencingproteincomplex),siRNA作为引导序列引导RISC与同源性的mRNA结合,解旋酶催化mRNA与siRNA的正义RNA链相互交换,siRNA的反义链与同源mRNA结合后,核酸酶在mRNA与siRNA反义链所形成的双链区的5′起始端下游7~10个核苷酸处(也就是双链区的靠近中间位置)切断mRNA,降解的mRNA被释放后,siRNA双链重新形成,可以继续降解同源的mRNA
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liuzeyi2002
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希望有做这方面的战友,多多发表心得!
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huaruishi
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有没有人用病毒做载体进行RNAi的呢?我现在是菜鸟,有很多问题想请教大家。
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tmxk1fwow
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4.siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNApolIII启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体的polIII启动子下游。由于涉及到克隆,这个过程需要几周甚至数月的时间,同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于siRNA表达,其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基因沉默。不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)。
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liuna8391
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想请教一个问题,VIGS毕竟是利用病毒来做载体的,我是做观赏植物RNAi的,这样不会对植物产生很大的影响吗?就算试验最后成功了,我育出的品种也没什么价值呀,因为它本身就是带病毒的,没法推广。
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茯苓猪爱
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有时间认真学习一下,呵呵
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kidandmoon
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受益良多!
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xingxuevic
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喜欢,谢谢了
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小呆和小瓜
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你好,我最近找公司合成了三段siRNA,结果转染效率很低,三个片段效果差不多,干扰效果都不太好。望指教啊~~~!
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jin_henjin
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高手啊,我才起步,谢谢啦!
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lili39
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新手上路,受益匪浅,谢谢
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jiyuyan168
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谢谢。收藏了
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蘑菇头老鼠
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收藏收藏,新手
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韩宏晓
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高手,以后要常来学习学习了
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sophia429
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好东西!可是解压不了啊!!
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马晓艳05_fly
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学习了!
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bikaqiucc
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虽然是很久之前的帖子,觉得非常不错,谢谢了
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晓晓317481504
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请问有大侠做过关于活体内的(大鼠)的干扰实验?用病毒包装的?谢谢
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摘星客2223
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晓晓317481504请问有大侠做过关于活体内的(大鼠)的干扰实验?用病毒包装的?谢谢我将要做这方面的实验,查找文献,找到了一种活体内沉默某种miRNA的文献,是通过注射化学修饰的寡核苷酸antagomirs实现的,也许对你可能有帮助lencing_of_microRNAs_in_vivo_with_‘antagomirs’.pdf(451.33k)
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zmzpxsz
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mark!
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ashley200888
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好贴...
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cindy630
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thanksalot!
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vivijo
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真好!谢谢大家!
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zzz0532
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收藏,留用
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武宣萍
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非常感谢楼主
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didiwu
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谢谢楼主
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杨树林117
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太好了,希望大家都能看到
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浅浅暖
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收藏了
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天边的线
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谢谢分享。
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fujingqi
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请教:siRNA同源的mRNA降解是整条mRNA都降解,还是同源区域附近?如果只是降解同源区域附近,是不是还能有蛋白片段表达出来?谢谢
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wxk_05
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谢谢楼主,学习了~
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