差异显示法

[原理]：

该实验方法是针对从特定细胞或组织类型的mRNA池来源的样品用PCR技术对其中许多的CDNA基因一起进行扩增和显示的实验方法。该实验方法倚赖两套不同类型的合成寡核苷酸引物：一套锚定反义引物与一套随机正义引物。锚定反义引物是与mRNA的poly(A)尾及3’-非翻译区的连接处相复性结合。正义引物是一种10-mer的随机引物，将锚定引物与随机引物加入反应混合液，用PCR技术进行双链cDNA产物的扩增。通过比较两种不同细胞类型或在不同生长条件下同种细胞类型来源的扩增cDNA产物的电泳带谱，能够用于鉴定其表达基因图谱的差异。

方法：

[优化DNA浓度：cDNA第一链的制备]

1．用几支0.5ml离心管，设立实验反应管系列，建立对照管和实验管的RNA最佳浓度。用水对RNA样品进行5倍连续稀释系列，产生RNA样品浓度范围在1μl/ml与100μg/ml之间系列。

2．从锚定3’-寡核苷酸引物库中选择一个或更多的引物，设立不同的稀释RNA模板量的复性反应系列：RNA模板8.0μl，锚定3’-寡核苷酸引物2.0μl。反应管在65℃水浴上温育10min，然后放置在37℃水浴上。

3．加入复性反应试剂：

5×DD-PCR反转录缓冲液4μl

100mmol/LDDT2μl

200μmol/L4种dNTP混合液2μl

约25单位/μlRnase抑制剂0.25μl

200单位/μl反转录酶20μl

H₂O补足至20μl

反应管温育样品管在37℃反应1h。

4．将反应管内样品在94℃加热10min，使反转录酶失活。

[优化RNA浓度：双链cDNA的扩增与制备]

5．用8只0.5ml扩增管设立两个实验系列。每只管应该包含如下试剂：

10×扩增缓冲液2μl

锚定3’-寡核苷酸引物2μl

20mmol/L4种dNTP混合液（pH8.0）1μl

[α-³²P]dNTP或[α-³²S]dNTP（3000Ci/mmol）1μl

5单位/μl热稳定DNA聚合酶1单位

H₂O9μl

对于每支反应管加入2μl5’随机引物，轻弹管壁使反应液混匀。

6．从含有测试RNA与对照管RNA的反转录的两个系列的8支试管中各取3μl样品，盖上试管，轻轻混匀样品。

7．如果PCR仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层加一滴矿物油（约50μl）。放置离心管在PCR仪上。

8．扩增反应有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：

9．扩增反应程序运行结束后，从PCR仪取出反应管，每支反应管各加入5μl5×测序胶上样缓冲液。

10．应用DNA序列分析型的电解质梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这种放射标记扩增物，电泳在稳定电源作用下进行，到二甲苯腈蓝电泳至凝胶长度的三分之二处结束。抽干凝胶，将凝胶放置在放射自显影底片的下部压片。

11．检查对照与试验RNA的不同浓度来源的扩增反应产物的DNA条带谱型。一种理想的差异显示的条带谱型最好能清晰地分辩100～250条电泳谱带。DNA模板的最佳量对于不同的样品、不同的引物也是个不相同的。选择对照与试验RNA的最适浓度，使得在该浓度下引物配对引导扩增得到最大量的DNA产物。

[用于差异显示的扩增cDNA的制备]

12．应用所有的引物组合与RNA模板最佳量，重新复性，反转录和扩增反应。设计在PCR仪上用96孔板即微量滴定板设立所有的反应循环。

13．应用聚丙烯酰胺测序胶电泳分离扩增反应产物，如步骤9和10。用每对引物所获得的扩增反应样品上样在测序凝胶上的毗邻的泳道上，比如应用配对引物A+B从一种RNA样品所获得的扩增样品与同一对引物A+B从另一种RNA样品所获得的另一个扩增产物在凝胶泳道上相邻。用这种方法对于样品编排序号后大大简化了对于放射自显影带谱的比较研究。

14．从不同的RNA样品中每一对引物所获得的扩增产物的带谱的比较研究。

[差异显示的cDNA的回收与重扩增]

15．从抽干的聚丙烯酰胺凝胶上回收目的条带。防止放射自显影X线片在凝胶的上方，对于放射自显影X线片上的目的条带的位置用软铅笔轻划标记。用干净剃须刀刀刃沿铅笔标记将上层的放射自显影胶片与下层的凝胶一并切割，切下每一条目的的条带，将目的条带的凝胶条贴放在Whatman3MM纸上；将每一薄片的抽干凝胶纸片放入一只0.5ml的离心管（内有50μl灭菌水）。

16．用小的针穿刺每一只浸泡过液的0.5ml的离心管的底部；把每一只穿刺管放入一只1.5ml离心管中，离心20s后将洗脱液转移至另一只更大的离心管中，丢弃扩增管中残余的凝胶条和Whatmen3MM纸条。

17．用已洗脱液中的DNA片段作模板，在扩增反应管中一次加入试剂：

10×扩增缓冲液2μl

聚丙烯酰胺凝胶中洗脱的DNA样品3μl

5’-随机寡核苷酸引物2μl

3’-锚定寡核苷酸引物2μl

20mmol/L4种dNTP混合液（pH7.0）1μl

5单位/μlTaq热稳定DNA聚合酶2单位

H₂O9.5μl

18．如果PCR仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油（约50μl）。放置离心管在PCR仪上。

19．扩增反应有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度如下表：

20．抽取每种重扩增样品的5%～10%，用1%（m/V）琼脂糖凝胶电泳来估计出重扩增DNA片段的含量。

21．若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层（步骤18），反应结束后可用150μl氯仿抽提去除。

22．将重扩增DNA片段连入一种带有dT尾的载体，取部分连接液转化大肠杆菌宿主菌。

23．从培养平皿上挑取6个或更多个转化菌落，抽提其质粒DNA，应用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定，通过比较插入片段的大小确定重组转化子。

24．应用尽可能多的途径和方法对差异表达的候补的cDNA/mRNA分子进行确证，这种方法包括Northern杂交，RNase保护或定量PCR。应用mRNA原位杂交技术能够对来自某种疾病或不同发育阶段的组织和差异表达的特异转录产物进行组织定位。