基因组文库构建步骤：·DNA的制备：高分子量的外源DNA100-150kb·剪切：随机切割·载体：l噬菌体：48.5kb,插入型(最多可容纳9kb)、取代型(可容纳38-51kb，最适19-20kb)，EMBL,Charon粘性质粒(Cosmid)：4-6kb,质粒+噬菌体的性质，可容纳大片段的外源基因，最多可容纳46kb。酵母人工染色体克隆体系（YAC，YeastArtificialChromosomeCloningSystem）插入大小200—1000kb·载体DNA的制备：载体DNA酶切反应-----载体臂的纯化-----载体脱磷处理（常用BamHI）（蔗糖密度梯度离心）（碱性磷酸酶）·连接和包装：外源片段与两臂之间的比例，包装蛋白·感染宿主菌：选择合适的宿主菌，LE392,NM538,NM539,KW251等·基因组文库的保存和扩增：完整性和代表性测滴度，要在10⁶fu以上;保存，氯仿4℃，7%DMSO-70℃人类染色体3X10⁹，平均插入片段大小17kb

cDNA文库的构建·分类：按表达类型分：表达型、非表达型按载体类型分：质粒cDNA文库、噬菌体cDNA文库·cDNA文库的构建步骤：·关键：mRNA的获得。完整、种类多、不能降解。电泳应在0.5-8kb之间。已知探针做Northern或PCR。·反转录：AMV鸟成髓细胞性白血病病毒M-MLV鼠白血病病毒引物：oligodT,Randomprimer掺入同位素检测·cDNA第二链的合成·载体：lgt10,lgt11,lZAP等。克隆入l噬菌体的效率是克隆入质粒中的30倍。lZAPII：(i)l噬菌体高效；(ii)质粒易操作；(iii)蓝白斑；(iv)插入大小10kb；(v)可表达融合蛋白，可用DNA探针或抗体来筛选；(vi)体内自我剪切·从少量RNA中建cDNA文库：一般情况下，只有10%的mRNA可变成可克隆的双链cDNA，而且体外包装和细菌转化都会再次降低效率，很多人结合PCR，但有非特异性。---结合Solid-phaseRNACaptureSystem,可用5ngmRNA，这时oligodT结合在一个磁珠上，做第二链的模板；---用UniversalBuffer，从cDNA第一、第二链的合成，到连Linker等全在一个系统内进行。·cDNA文库的标准化：使高丰度的信息相对减少、低丰度的信息相对增多的过程。减少反复重复，但也会丢失一些信息。----与基因组DNA杂交；---应用二级动力学原理在溶液中使双链DNA再退火。理论上，在单细胞中，去除高丰度者可使低丰度者聚集3倍或更少。因为细胞中1/3mRNA在细胞中有1-10拷贝。·定向克隆的cDNA文库：大量EST测序时会用到。·好的cDNA文库的标准：---具有代表性，含所有带PolyA尾的RNA群体且各类型出现频率也与之一致；---大部分含有较长或全长的cDNA插入序列；---少有基因组、线粒体DNA、核糖体RNA的污染。·cDNA文库的筛选：DNA探针，抗体，标记蛋白文库的扩增：噬菌体文库加SM，粘粒和质粒文库LB。文库的保存：噬菌体文库：4℃（加氯仿）可保存几年，-70℃（7%DMSO）长期保存；粘粒和质粒文库：15%甘油，-70℃冻存。文库的筛选：·选择文库·所要筛选的克隆数：--对基因组文库取决于克隆片段的大小和基因组的大小N=Ln(1-P)/Ln[1-(I/G)]其中I：克隆片段的随机大小，G：靶基因组的大小，P：分离到基因的概率。--对cDNA文库取决于所要片段的表达丰度和基因组的大小用核酸做探针还是用抗体做探针