![StremChemicals/Tris(6,6,7,7,8,8,8-heptafluoro-2,2-dimethyl-3,5-octanedionate)neodymium(III), 99% (99.9%-Nd) (REO) [Nd(FOD)3]/5g/60-5500-5g](images/Strem/60-5500.gif)
| CAS Number: | 17978-76-6 |
| MDL Number: | MFCD00798419 |
| Molecular Formula: | C30H30F21NdO6 |
| Formula Weight: | 1029.77 |
| Chemical Formula: | Nd(C3F7COCHCOC4H9)3 |
| Color and Form: | blue-pink solid |
| Note: |
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1，测序技术的改进：全基因组主要应用的是illumina的Hiseq X10的测序平台，该平台在图片信息处理和flowcell上都有很大的改进（原来是平板上长簇，现在上面有小孔），另外在扩增的技术上也有一点改进（RPA扩增技术）。以上几点使得数据的通量大大调高。所以相应的测序价格也会降低。
2，市场占有策略：这一点我个人理解比技术更新更重要，illumina的战略思路，占有测序市场。其实illumina的Hiseq X10的测序平台试剂要比其他平台的试剂便宜很多。不过这个平台签有协议，只能做人的全基因组重测序项目。
直接测序法是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的方法.重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶.最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化.此方法一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态.在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点.测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列.它的不足是耗费时间和耗资过多,至少要测序10个以上的克隆才能获得可靠数据,需要大量的克隆及质粒提取测序,过程较为繁琐、昂贵.
第一部分 基因组DNA的提取.
这一步没有悬念,完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒,如果实验室条件成熟,自己配试剂提取完全可以.DNA比较稳定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因组DNA应该是完整的.
此步重点在于DNA的纯度,即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者.
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在购买市售RNA酶后进行再处理,配制成10mg/ml.否则可能的后果是不仅没有RNA,连DNA也被消化了.两者均于-20度保存.
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳.
我倾向于第二种方法,这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度,并根据Marker的上样量估计其浓度,以用于下一步的修饰.
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出,所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌.
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌）,加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma,S9000）,配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释,并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,最终体积为5ml.这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶,但加入NaOH后会慢慢溶解,需要有耐心.PH一定要准确为5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.
6：EP管外裹以铝箔纸,避光,轻柔颠倒混匀溶液.
7：加200 ul 石蜡油,防止水分蒸发,限制氧化.
8：50℃避光水浴16h.
一般此步在4pm开始做,熟练的话不到5pm即可完成,水浴16h正好至次日8am以后收,时间上很合适.
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确,宁多勿少,因为在以后纯化回收步骤中会有丢失,且此方法修饰最多可至4ug.
2：所有试剂均须新鲜配制,所以配液的技术要过关,既要快,又要精确.
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性,一定用碱将PH调制5.0,否则PH不合适会影响后续纯化吸收.
4：水浴最好达16小时,虽可以短至8小时,但后者修饰会有不完全.
第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的.
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出,然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中.
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega,A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,轻柔颠倒混匀,使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓,如果有真空负压吸引器,使用起来很方便；如果没有,需要自备3ml-5ml注射器.将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后,将上述混合物用移液器移至针筒内,用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液.加针栓,轻轻加压,将液体挤出,此时可见小柱内有白色的树脂沉积.
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓,再将针筒与小柱连接,向针筒内加入2ml 80％的异丙醇,插入针栓,轻轻加压,将异丙醇挤出.此为洗涤步骤.
5）将注射器与小柱分离,将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上,离心12000rpm,2min,以甩去残余异丙醇成分,使树脂干燥.此时,修饰后DNA处于与树脂结合状态.
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上,移液器加50ul预热好的DDW,室温放置5min.
7）离心12000rpm,20s,此为洗脱步骤,此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液,终体积为50ul.
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH,室温放置15min.
4：加33ul 10M乙酸铵,以中和NaOH,使溶液PH于7.0左右.
5：加4ul 10mg/ml糖原,此作为沉淀指示剂,因为其与乙醇混合后可产生沉淀,便于以后离心后辨别回收物的位置,以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走.其实,加入这些糖原究竟能起多大作用,不好说.不过有国产糖原卖,包装不大,也很便宜,买来一用,算严格遵守文献的步骤吧.
6：加270ul 冰无水乙醇,置于-20度,过夜沉淀.有人为沉淀最短可至2小时,但我认为时间长些可能会更好.并且做到此步骤时,一般会到中午,如果样本多的话要到下午,不妨放置过夜,日程可以轻松些,顺便做些其他试验.如果想当天做完,没有问题,但我认为最好多沉淀些时候,至少6小时吧（这是经验,我做过最少6小时,也是可以的,再短就不敢发表意见了）
7：4度,12000rpm离心,30min,倒去上清液,收集沉淀.不必吸净.
8：加500ul 70%乙醇,不要将沉淀吹打起来,只要把乙醇加上即可.轻柔倾斜EP管,旋转一圈,再次离心,4度12000rpm,5min.离心后倒掉上清,再加同量乙醇,同样再做一遍.此为洗涤步骤,共2次.
9：倒掉上清,并常温简短离心后,将附壁乙醇离至EP管底,移液器小心将残余液体吸净,室温干燥5min,或沉淀由不透明变为半透明或透明时,加入20ul- 30ulDDW,溶解沉淀.至此,已完成了修饰后DNA的纯化回收,所得为修饰后DNA溶液,可用于此后的进一步实验.
10：-20℃保存DNA溶液.
此步细节：
1：在使用注射器时,一定要用力均匀且轻,如使用暴力,会将小柱内的薄膜挤破,失去作用.
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制,糖原配好后放在-20度保存,乙酸铵室温即可,因为这样浓度的乙酸铵非常难溶,一旦放在4度,取出用时也会有很多溶质析出.
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制,但如果用量大,现场配也很方便.
此步关键是在树脂与DNA的结合上,这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性.因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH,如前一步没做好,此步树脂不能与DNA很好结合,将会带来灾难性后果,即DNA随着液体被挤出了,洗脱时实际已没有任何DNA了.
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念.我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度,我曾设计过几对引物,并且试验了一下,但以失败告终.如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多,自己设计引物没有问题.如果不是这样,还是参考文献更好些.首先查阅SCI分值高的文献,然后是著名实验室的文献,如果国内有做的,更好了,可以直接联系咨询.查到序列后,一定要和Genbank中的序列进行比对,防止有印刷错误造成的个别碱基的差别.然后再到google上搜一下,看用的人多否,体系条件是否一样.用的人多、体系条件一样,表明可重复性比较强.我也是按此行事,算比较顺利.
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌 Taq（Platinum）,但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适,一般的热启动酶是可以的.我开始使用的是Takara的LA Taq,很好用,配有10x含mg++的LA缓冲液.有时候用没了,暂时以Takara 的普通Taq酶也可以.如何选择,可以根据自己的情况.初作者还是用好一点的酶.
3：PCR的条件：变性一般都选择95度,3min.其余我感觉还是根据文献,退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试.一般和文献报道差别不大.只是扩增片断特异性的问题.建议根据文献.
4：做PCR的EP管最好选择进口的,壁薄且厚度均匀,这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液,使体系真正在所设定的温度下运行.
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了,最好一直用此仪器继续.不同的仪器“脾气”也不一样,但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好,留有空隙,我认为会影响温度的传递.
这一部分有些啰嗦,只是个人一些不成熟经验.有疑问处,请大家指出,交流.今天先到这里,现写一些内容,比较费劲,总是不能一挥而就.望见谅.歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分.
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单,可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒,国产的就很好、价格也合理,比如TIANGEN的产品（用过）.把切下来的胶按说明书操作即可.
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,要使用新配的电泳液.凝胶浓度1%-2%均可.
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置,切取目的片断所在位置的凝胶,尽量小,保证特异性.
3：紫外照射时间不能过长,否则对DNA有损伤.
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度,在数月内是很稳定的.
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度,过夜.
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌,融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入,至于冰上30分钟；
3）42度, 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm,37度,摇床45分钟（将管放水平了摇,保证菌液摇匀）；
7）8000rpm,1分钟；在超净台内去上清,留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点,取白色斑点,尤其是蓝色斑点周围的白色斑点,此处自联率较低.
3：取白斑,划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区,进行标记.根据需要,一般一板作50个克隆没有问题.
针头挑白斑划2道于板上相应区域内.
37度,孵箱过夜.
4：联系测序公司送测序.一般一个克隆在35-45元.
这一部分的细节：
1：涂板要均匀,保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满,否则选取克隆时容易一下挑2个.
本人刚接触二代测序不久，因此对于测序定量这方面存在一些问题，希望大神们能帮助解一下，谢谢！！
我们使用的仪器是Illumina公司的nextseq500。在混样前会先进行荧光定量PCR（ABI7500），我一般是将文库稀释到4ng左右，稀释10000倍进行定量
1.同一批构建的同一种类型的文库，在定量时会有个别文库定量结果不准，复孔没问题（依据是我已将文库稀释到同样的ng数进行定量，所以得到的pm数应该在一个接近的范围内，但有的样本差异比较大），这种情况我一般会根据qubit定量将定量不准的个别样本参考其他样本的浓度进行稀释，下机数据量确实与校准的结果一致，说明应该是荧光定量的问题，这种情况在几种类型的文库中都有发生，文库一般在400bp左右。想问下这种情况是属于定量的问题还是文库自身的问题。
2.按照荧光定量的结果进行混样然后上机，每次我们混合后的文库都会进行qubit定量，大概会有一个上机参考值
（前提是不含有大片段的文库），但qubit值接近的文库上机的clusterdensity却相差很大，这是什么原因造成的？不同项目的文库会有影响，但我们文库的片段大小基本一致。有什么好的办法解决么？
3.最近按照荧光定量的浓度混合的文库上机，数据量总会超过预期很多，致使Q30很低，影响数据质量，采用的是7500机器，KAPA的定量试剂盒，机器才校准过，会不会是测序仪自身的问题？如果不是我们应该如何解决？
4.我们一般采用中通量测序盒子，大概每次上机在30个文库左右，数据量分配有时差别比较大（500M-8G），这样分配数据量可以完全按照荧光定量的结果分配么，数据量大的文库会不会成簇效率更高一些，使数据量小的文库得不到相应的数据量了？
5.除了2100和荧光定量这两种方法，还有什么其他的方法可以评价文库质量么？
6.现在上机文库得到的数据量有时与预期偏差较大，问题都在定量混合这块么？还有什么其他地方可能有问题么？
摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。
图1：测序技术的发展历程
生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术
第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）.并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。
图2：Sanger法测序原理
第二代测序技术
总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。表1和图3对第一代和第二代测序技术各自的特点以及测序成本作了一个简单的比较5，以下我将对这三种主要的第二代测序技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。
图3.测序成本的变化
Illumine
Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的2,4。这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法，它的测序过程主要分为以下4步，如图4.
（1）DNA待测文库构建
利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。
（2）Flowcell
Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。
（3）桥式PCR扩增与变性
桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增，如图4.a所示。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。
（4）测序
测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间，测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约为1周。
图4.Illumina测序流程
Roche454
Roche454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理是（图5abc）2：
（1）DNA文库制备
454测序系统的文件构建方式和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA文库（图5a）。
（2）EmulsionPCR（乳液PCR，其实是一个注水到油的独特过程）
454当然DNA扩增过程也和illumina的截然不同，它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。
乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”（水包油），基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。
这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增，并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后，可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。
（3）焦磷酸测序
测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上。这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。
测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，从而导致荧光淬灭，以便使测序反应进入下一个循环。由于454测序技术中，每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，当前454技术的平均读长可达400bp，并且454技术和illumina的Solexa和Hiseq技术不同，它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，这就有可能导致结果不准确。也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。
图5.Roche454测序流程
Solid技术
Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。它基于连接酶法，即利用DNA连接酶在连接过程之中测序（图6）2,4。它的原理是：
图6-a.Solid测序技术
（1）DNA文库构建
片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。
（2）EmulsionPCR
Solid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsionPCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域（图6-a）。Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。
（3）连接酶测序
这一步是Solid测序的独特之处。它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3’-XXnnnzzz-5’。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图6-a）。这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。这是Solid的独特测序法，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基。这种测序方法也称之为两碱基测序法。当荧光探针能够与DNA模板链配对而连接上时，就会发出代表第1，2位碱基的荧光信号，图6-a和图6-b中的比色版所表示的是第1，2位碱基的不同组合与荧光颜色的关系。在记录下荧光信号后，通过化学方法在第5和第6位碱基之间进行切割，这样就能移除荧光信号，以便进行下一个位置的测序。不过值得注意的是，通过这种测序方法，每次测序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在测到末尾后，要将新合成的链变性，洗脱。接着用引物n-1进行第二轮测序。引物n-1与引物n的区别是，二者在与接头配对的位置上相差一个碱基（图6-a.8）。也即是，通过引物n-1在引物n的基础上将测序位置往3’端移动一个碱基位置，因而就能测定第0、1位和第5、6位……第二轮测序完成，依此类推，直至第五轮测序，最终可以完成所有位置的碱基测序，并且每个位置的碱基均被检测了两次。该技术的读长在2×50bp，后续序列拼接同样比较复杂。由于双次检测，这一技术的原始测序准确性高达99.94%，而15x覆盖率时的准确性更是达到了99.999%，应该说是目前第二代测序技术中准确性最高的了。但在荧光解码阶段，鉴于其是双碱基确定一个荧光信号，因而一旦发生错误就容易产生连锁的解码错误。
图6-b.Solid测序技术
第三代测序技术
测序技术在近两三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。
其中PacBioSMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想5，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是：DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记4种碱基（即是dNTP）,在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。同时这个DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。PacBioSMRT技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW（零模波导孔）原理：如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔。小孔直径有考究,如果直径大于微波波长,能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来，从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长,能量不会辐射到周围，而是保持直线状态（光衍射的原理）,从而可起保护作用。同理,在一个反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多这样的圆形纳米小孔,即ZMW(零模波导孔),外径100多纳米,比检测激光波长小(数百纳米),激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区,能量被限制在一个小范围(体积20X10-21L)里,正好足够覆盖需要检测的部分,使得信号仅来自这个小反应区域,孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中,从而实现将背景降到最低。另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息（图7）。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），达到15%,但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。
图7.PacBioSMRT测序原理
OxfordNanoporeTechnologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术5。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基（图8）。
该公司在去年基因组生物学技术进展年会(AGBT)上推出第一款商业化的纳米孔测序仪，引起了科学界的极大关注。纳米孔测序（和其他第三代测序技术）有望解决目前测序平台的不足，纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100kb;错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端;数据可实时读取;通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成);起始DNA在测序过程中不被破坏;以及样品制备简单又便宜。理论上，它也能直接测序RNA。
纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。并且改方法的测序准确性可达99.8%，而且一旦发现测序错误也能较容易地进行纠正。但目前似乎还没有应用该技术的相关报道。
图8.纳米孔测序
其他测序技术
目前还有一种基于半导体芯片的新一代**性测序技术——IonTorrent6。该技术使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应池中的PH发生改变，位于池下的离子感受器感受到H+离子信号，H+离子信号再直接转化为数字信号，从而读出DNA序列（图9）。这一技术的发明人同时也是454测序技术的发明人之一——JonathanRothberg，它的文库和样本制备跟454技术很像，甚至可以说就是454的翻版，只是测序过程中不是通过检测焦磷酸荧光显色，而是通过检测H+信号的变化来获得序列碱基信息。IonTorrent相比于其他测序技术来说，不需要昂贵的物理成像等设备，因此，成本相对来说会低，体积也会比较小，同时操作也要更为简单，速度也相当快速，除了2天文库制作时间，整个上机测序可在2-3.5小时内完成，不过整个芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常适合小基因组和外显子验证的测序。
图9.IonTorrent
小结
以上，对各代测序技术的原理做了简要的阐述，这三代测序技术的特点比较汇总在以下表1和表2中。其中测序成本，读长和通量是评估该测序技术先进与否的三个重要指标。第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外，其测序核心原理（除Solid是边连接边测序之外）都是基于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，并要保持二代技术的高通量，低成本的优点。
表1：测序技术的比较
表2：主流测序机器的成本测序比较
以下图10展示了当前全球测序仪的分布情况。图中的几个热点区主要分布在中国的深圳（主要是华大），南欧，西欧和美国。
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肽度时界
2016年02月01日发布
关于公布注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品目录的通知
为配合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）的实施执行，现将供注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品形成目录，公布如下。
注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品目录（第一期）
序号名称品种编号供应情况1促甲状腺素（TSH）免疫测定用国家标准品150530正常供应2促黄体生成素（LH）免疫测定用国家标准品1505313人绒毛膜促性腺激素β亚单位（hCG-β）免疫测定用国家标准品1505354人胎盘泌乳素（HPL）免疫测定用国家标准品1505365甲胎蛋白（AFP）免疫测定用国家标准物质1505426前列腺特异性抗原（PSA）免疫测定用国家标准物质1505437游离前列腺特异性抗原（f-PSA）免疫测定用国家标准品1505448三碘甲腺原氨酸（T3）免疫测定用国家标准品1505509甲状腺素（T4）免疫测定用国家标准品15055110反三碘甲腺原氨酸（rT3）免疫测定用国家标准品15055211胰高血糖素（Glucagon）免疫测定用国家标准品15055412人绒毛膜促性腺激素（HCG）免疫测定用国家标准品15055513淋病PCR试剂盒质控参考品21001514结核分支杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品23003015结核分支杆菌利福平耐药基因检测试剂用国家参考品23003316结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品23003417测序仪性能评价用脱氧核糖核酸国家参考品36000718人脲原体核酸检测国家参考品36000919第一代H7N9禽流感病毒核酸参考品37000120EB病毒衣壳抗原IgA抗体国家参考品37000221甲型流感病毒抗原检测试剂国家参考品37000322乙型流感病毒抗原检测试剂国家参考品37000423甲/乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品37000624扎伊尔型埃博拉病毒核酸检测试剂国家参考品37001025甲型流感病毒核酸检测试剂国家参考品37001126乙型流感病毒核酸检测试剂国家参考品37001227甲/乙型流感病毒抗原检测试剂国家参考品37001328甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂国家参考品37001429抗HTLV抗体国家参考品220003限制供应，每企业只供应2套/年30HIV抗体国家参考品22000931SARS病毒抗体IgM国家参考品22001032SARS病毒抗体（总抗体或IgG）国家参考品22001133HIV-1RNA国家参考品22001734HIV-1耐药性分析试剂国家参考品22001835HIV抗体尿液快速检测试剂国家参考品22002036乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）国家参考品30000337乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）国家参考品30000538乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）国家参考品30000639乙型肝炎病毒核心抗体(Anti-HBcAb)国家参考品30000740戊型肝炎病毒IgM抗体国家参考品30001141戊型肝炎病毒IgG抗体国家参考品30001442丙型肝炎病毒抗体国家参考品300010限制供应，每企业只供应1套/年
注：1.相关品种电子版说明书可到中国食品药品检定研究院网站http://www.nifdc.org.cn/bzwz/CL0481/,点击目录查询，进行在线浏览。
2.限制供应是指仅供给相关体外诊断试剂生产企业。
二〇一六年二月一日
根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。 基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。
由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
一、准备工作
1. BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。
2. pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2 g/L，试剂盒配套试剂。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，试剂盒配套试剂。
4. DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2 g/L，即200 ng/μl。
5. 引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6. 灭菌去离子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 盖体分离。
8. 3 mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100 ml，高压灭菌后分装。
9. 70%乙醇和无水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml无水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。
11. POP 6测序胶 。
12. 模板抑制试剂(TSR) 。
13. 10×电泳缓冲液 。
14. 全自动DNA测序仪。
15. PCR仪。
16. 台式冷冻高速离心机。
17. 台式高速离心机或袖珍离心机。
二、PCR测序反应
1. 取0.2 ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：
所加试剂 测定模板管 标准对照管
BigDye Mix 1 μl 1 μl
待测的质粒DNA 1 μl －
pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1 μl
待测DNA的正向引物 1 μl －
M13(-21)引物 － 1 μl
灭菌去离子水 2 μl 2 μl
总反应体积5 μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
2. 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2 min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
三、醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
1. 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗涤沉淀2次。12 000 r/min于4℃离心5 min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。
四、电泳前测序PCR产物的处理
1. 加入12 μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
2. 将溶液转移至盖体分离的0.2 ml PCR管中，稍离心。
3. 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2 min)，冰中骤冷，待上机。
五、上机操作 1. 按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。 2. 仪器将自动灌胶至毛细管，1.2 kV预电泳5 min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下电泳2 h。 3. 电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。 4. 每一个样品电泳总时间为2.5 h。 5. 电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
六、序列分析 仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
七、仪器清洗 测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
八、计算
1. 测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%。
2. 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。 SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外，SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。
Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP（7-deaza dGTP，或dITP）替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。
退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物（<500bp）得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。
由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03～2pmol模板DNA，随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA（dsDNA）模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板（如PCR反应产物）快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。
一、试剂准备
1. SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。
2. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V）：95 g丙烯酰胺，5 g甲叉双丙烯酰胺溶于140 ml 双蒸水中，定容至250 ml，0.45 mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。
3. 10%过硫酸铵，0.5 g过硫酸铵溶于4 ml水中，定容至5 ml，应新配新用。
4. 10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris， 0.83mol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA）： 121.1 g Tris，51.35 g硼酸，3.72 g Na2EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。
5. TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。
6. TEMED
7. 固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。
8. 染色溶液：硝酸银2 g，甲醛3 ml，溶于2升超纯水中备用。
9. 显影溶液：60 g碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3 ml 37%甲醛和40 ml硫代硫酸钠溶液（10 mg/ml）。
10. 95%乙醇。
11. 0.5%冰乙酸。
12. Sigmacote （Sigma CAT. #SL-2）。
二、测序反应
1. 对于每组测序反应，标记四个0.5 ml eppendorf管（G、A、T、C）。每管加入2 ml适当的d/ddNTP混合物（d/ddNTP Mix）。各加入1滴（约20 μl）矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应，在一个eppendorf管中混合以下试剂：
（1） 样品反应：
质粒模板DNA ：2.1 pmol
5×测序缓冲液 ： 5 ml
引物： 4.5 pmol
无菌ddH2O 至终体积16 ml
（2）对照反应
pGEM-3Zf（+）对照DNA（4 mg） ：4.0 ml
5×测序缓冲液： 5 ml
pUC/M13正向引物（4.5 pmol） ：3.6 ml
3. 在引物/模板混合物（以上第2步）中加入1.0 ml测序级Taq DNA聚合酶（5 μ/ml）。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以【注意】中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。
7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3 μlDNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。
【注意】
（1）测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板种类/长度 模板量
200 bp（PCR产物）：16 ng（120 fmol）
3000～5 000 bp（超螺旋质粒DNA）： 4 mg（2 pmol）
48 000 bp（λ,粘粒DNA）： 1 mg（31 fmol）
由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
（2）计算与4.5 pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：
4.5 pmol=1.5 ng×n，其中n为引物碱基数
计算与1p mol相当的引物微克数可用以下一般公式：
dsDNA：1 pmol=（6.6×10mg）×n，其中n为模板碱基对数
ssDNA：1pmol=（3.3×10mg）×n，其中n为模板碱基数
（3）为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。
模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%
95℃ 2分钟，然后： 95℃ 30秒（变性），42℃ 30秒（退火），70℃ 1分钟（延伸）。
模式2：适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分钟，然后：95℃ 30秒（变性），70℃ 30秒（退火/延伸）。
（4）在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。
三、测序凝胶板的制备
1. 玻璃板的处理
银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高（棕色）。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
（1）短玻璃板的处理
① 在1 ml95%乙醇，0.5%冰乙酸中加入5 ml粘合硅烷（Bind Silane），配成新鲜的粘合溶液。
② 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板，整个板面都必须擦拭。
③ 4～5分钟后，用95%乙醇单向擦玻璃板，然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程，每次均须换用干净的纸，除去多余的粘合溶液。
【注意】
① 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷，使凝胶不能很好地粘附。
② 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。
③ 防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的，否则将导致凝胶撕裂。
（2）长玻璃板的处理：
① 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。
② 5～10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。
【注意】
① 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10%NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染，用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开，如果出现交叉污染，以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。
2. 凝胶的制备
（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2 mm或0.4 mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。
（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%～8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2 ml，并用0.45 mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4～6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。
（3）胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。
【注意】
① 使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
② 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。
四、电泳
1. 预电泳
（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。
（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。
（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。
（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。
（5）按30 V/cm的电压预电泳20～30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。
【注意】
① 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。
② 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。
2. 样品的制备
当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1～3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4～6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4 mm。厚度小于0.4 mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。
3. 上样及电泳
关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30 V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40～60 V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55 cm长，0.2 mm厚的凝胶板，在2500 V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28 mA降至25 mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。
【注意】
① 上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。
② 一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。
五、测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶（连玻璃板）放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没，充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜（不振荡）。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出，当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10～20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影
（1）在显影溶液中加入甲醛（3 ml）和硫代硫酸钠溶液（400 μl）以完成显影液的配制。
（2）从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5～10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5～10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长，可重复第五步用染色液浸泡。
（3）立刻将凝胶转移至1升（总量的一半）预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带，把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2～3分钟或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应，固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景（如纸）上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
【注意】
测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响
① 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水（NANOpureR或Milli-QR的水）或双蒸水可获得较好的效果，如果水中有杂质，则低分子量条带可能无法出现。
② 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠（Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990），一般可获得较好的结果。
③ 色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA，产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。
④ 如果凝胶厚度超过0.4 mm或丙烯酰胺浓度高于4～6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4 mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。
⑤ 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10～12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。
六、EDF胶片显影
使用EDF胶片可增强测序条带的对比度，如果测序胶上条带很淡，我们建议把数据转移至EDF胶片，银染胶在其影像转移至EDF胶片之后可增强条带可读性。
1. 在暗室内，将染色过的粘于玻璃板的凝胶（胶面向上）置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板，亦可用白灯箱，为确保曝光时间，用一小条EDF胶片曝光不同时间，检查不同的曝光强度，一般曝光20～40秒可得较好结果。
2. 在红灯下找到EDF胶片有缺刻的一角，然后把胶片置于凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的，因此必须确保缺口在左上角。
3. 在EDF胶片上放置一干净、干燥的玻璃板，开亮灯箱约20秒。
4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF胶片，可使用下列操作过程：
（1） 在Kodak GBX显影液中显影1～5分钟；
（2） 水洗1分钟；
（3）在Kodak GBX定影液中定影3分钟；
（4）水洗1分钟。
【注意】
① 进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作，以免印上指纹。同时注意EDF胶片不能用自动胶片处理器。
② 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同，通过对一小条EDF胶片曝光不同时间以选择你所用光源的最佳曝光时间，参阅胶片说明书。
③ 曝光时间短则EDF胶片影像较深，曝光时间长则有助于减弱背景。 “鸟枪法”是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。
这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。
一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA，并用Agarose凝胶电泳进行回收。
二、对回收的大片段DNA用物理方法（如超声波等）进行切断处理，然后用T4DNAPolymerase对小片段DNA进行末端平滑化。
三、进行Agarose电泳，切胶回收1kbp～2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。
四、把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。
五、对阳性克隆（含1kbp～2kbpInsert）进行DNA测序。
六、对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。向左转|向右转
