产品信息

产品描述

HieffClone^TMPlusOneStepCloningKit是一款简便、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，可高效克隆50bp-10kb片段。将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，仅需50℃反应20min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。

产品组分

产品应用

快速克隆；定向克隆；定点突变。

运输与保存方法

冰袋运输。-20ºC保存，有效期1年。

实验流程

一.制备线性化载体

选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化。建议尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。载体克隆位点上下游25bp区域内GC含量均在40%-60%范围内最佳。线性化载体可通过限制性内切酶酶切或反向PCR扩增获得。

1.酶切制备线性化载体

1）双酶切线性化：线性化完全，转化背景低。建议使用。

2）单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。

【注】：不含插入片段的假阳性克隆是由未线性化环状载体转化而形成的。若这种假阳性克隆比例较高，建议重新制备线性化载体。

2.反向PCR扩增制备线性化载体

建议使用高保真聚合酶（如：HieffCanace^TMHigh-FidelityDNAPolymerase，CatNo.10135ES）进行载体扩增，以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。

HieffClone^TM重组反应体系兼容几乎所有酶切反应体系和常规PCR反应体系，当载体酶切产物或反向PCR扩增产物纯度较高时，可以无需纯化，直接进行重组反应。但纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒时，建议使用高质量的试剂盒对线性化载体进行胶回收纯化，以提高产物纯度并去除一部分未线性化的环状载体，有利于提高重组效率。

二.PCR扩增制备插入片段

1.设计扩增引物

HieffClone^TM引物设计方式：通过在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25bp（不包括酶切位点）的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。

插入片段正向扩增引物设计方式：

5’—上游载体末端同源序列+酶切位点（可保留或删除）+基因特异性正向扩增引物序列—3’

插入片段反向扩增引物设计方式：

3’—基因特异性反向扩增引物序列+酶切位点（可保留或删除）+下游载体末端同源序列—5’

【注】：①基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；

②上游/下游载体末端同源序列为线性化载体最末端序列（用于同源重组），GC含量40%-60%为佳。

推荐使用翊圣无缝克隆引物设计软件（http://122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自动生成插入片段的扩增引物。若手动设计，可参照以下实例

图2插入片段引物设计方案

【注】：最终引物长度超过40bp，建议选用PAGE纯化方式进行引物合成。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算，为了得到高效率克隆，建议Tm≥48℃。

2.插入片段PCR扩增

插入片段扩增可用任意PCR酶扩增，无需考虑产物末端有无A尾(重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。但为了减少扩增突变的引入，建议使用高保真聚合酶进行扩增（HieffCanace^TMHigh-FidelityDNAPolymerase，CatNo.10135ES）。

PCR扩增结束后，取少量产物进行琼脂糖凝胶电泳以检验扩增产量和特异性。HieffClone^TM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如果扩增模板不是与载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，则扩增产物可以无需纯化，直接用于重组反应。但PCR扩增产物纯度较低时，建议使用高质量的试剂盒对PCR扩增产物进行胶回收纯化，以提高产物纯度，有利于提高重组效率。

三.线性化载体与插入片段浓度测定

推荐使用琼脂糖凝胶电泳比较条带亮度的方法对DNA进行定量。将线性化载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度，原始产物和稀释后产物各取1μL进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA分子量标准（DNAMarker）比较条带亮度以确定其近似浓度。

四.重组反应

1.线性化载体与插入片段使用量计算

HieffClone^TM重组反应体系最适载体使用量为0.03pmol；最适载体与插入片段摩尔比为1:2-1:3，即最适插入片段使用量为0.06-0.09pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

最适载体使用量=[0.02×载体碱基对数]ng(0.03pmol)

最适插入片段使用量=[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)或=[0.06×插入片段碱基对数]ng(0.09pmol)

例如，将长度为2kb的插入片段克隆至长度为5kb的载体时，载体的最适使用量应为：0.02×5000=100ng；插入片段最适使用量应为：0.04×2000=80ng或0.06×2000=120ng。

【注】：1）当插入片段长度大于载体时，最适载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即插入片段当做载体，载体当做插入片段进行计算。

2）线性化载体的使用量应在50-200ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在20-200ng之间。当使用上述公式计算最适使用量超出这个范围时，则选择最低或最高使用量即可。

3）线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20μL体系不超过4μL。

2.反应体系（推荐冰上配制，各组分使用前需混匀）

【注】：1）X和Y分别是根据公式计算得到线性化载体和插入片段用量。

2）阴性对照-1可用来确认线性化载体有无环状质粒残留，可选择性进行。

3）当插入片段扩增模板是与载体抗性相同的环状质粒时，可用阴性对照-2来确认有无环状质粒模板残留，可选择性进行。

4）试剂盒中提供阳性对照反应所需组分，可用来排除其他实验材料及操作因素的影响，可选择性进行。

3.重组反应

1）体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。

2）置于50℃反应20min。当插入片段＞5kb时，可将孵育温度延长至25min。

【注】：建议在PCR仪或水浴锅等温控精确的仪器上进行反应。

3）待反应完成后，建议将反应管置于冰上冷却5min，以防温度过高降低感受态转化效率。

4）反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

五.重组产物转化、涂板

1）在冰上解冻克隆感受态细胞（如：DH5αChemicallyCompetentCell，CatNo.11802ES）。

2）取10μL冷却重组产物，加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。

3）42℃热激90秒，冰浴孵育2min。

4）加入900μLSOC或LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃，200rpm，摇菌45min。

5）5000rpm离心3min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收，将平板倒置，于37℃过夜培养。

六.克隆鉴定

最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20-50μLLB培养基中混匀，直接取1μL作为PCR模板。推荐至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。后续也可做酶切或测序鉴定。

应用实例

          图3：HieffClone^TMPlusOneStepCloningKit可以有效克隆不同长度的单片段基因。

A-D：重组转化平板。E：插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H：插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体：pFastBac1，4.7kb，插入片段大小分别是1.2kb，3kb和5kb，载体与插入片段摩尔比：1:3，重组反应条件：50℃，20min。

常见问答

1、最佳克隆位点选择？

答：在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游25bp区域内GC含量均在40%-60%范围内时，重组效率将达到最大。若高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。

2、无克隆长出或克隆数较少？

答：出现该情况，建议同时使用试剂盒所附带的阳性对照，可排除试剂盒本身的影响，并进行进一步判定，主要有以下可能情况：

1）引物设计不合适：推荐【同源序列（15-25bp）+完整的酶切位点+基因特异性扩增引物】，GC含量40%-60%。

2）感受态细胞效率低：使用新鲜制备或妥善冻存的感受态细胞，确保其转化效率>10⁷cfu/μg。每次操作时可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。选择克隆感受态细胞(如DH5α)，不能选择表达感受态细胞。

3）线性化载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：尽量按照推荐的量和比例配制重组反应体系。

4）线性化载体和插入片段扩增产物不纯，抑制反应：线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20μL体系不超过4μL。建议线性化载体、插入片段扩增产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在ddH₂O中。

 3、 出现较多假阳性

答：主要有以下可能情况：

1）载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。可通过阴性对照检测载体是否线性化完全，优化酶切体系，提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等都可以有效减少环状质粒残留。

2）插入片段扩增产物混有非特异扩增产物：建议：①优化PCR体系，提高特异性；②胶回收PCR产物；③鉴定更多克隆。 

3）反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板(载体或插入片段)为环状质粒时，若扩增产物直接用于重组反应，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。建议使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化或扩增产物进行胶回收纯化。

4、菌落PCR无条带

答：主要有以下可能情况：

1）引物不正确：推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌落PCR检测。

2）PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空质粒条带，建议优化PCR体系、程序；或者提取质粒，以质粒做模板PCR验证；或者进行酶切验证。

3）重组失败：没有目的条带，只有空质粒的条带，说明重组不成功，载体线性化不完全，建议优化酶切体系。

HB180228