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제품특징
□ 특징
● 간단하고 민감하게 promoter 활성을 관찰
● 강력하고 안정적인 signal
● 살아 있는 세포 분석 - time course 실험에 적합
● High-throughput 실험에 최적
Clontech의 live cell secreted reporter는 다른 transcriptional reporter 이상으로 많은 장점을 갖고 있다. 이들은 배양 배지로 분비되기 때문에 반복적으로 같은 배양액을 시료로 하여 유전자 발현에 대한 kinetics를 측정할 수 있다. 또한 Northern blot, RNase protection assay, Western blot과 같은 방법을 사용하여 같은 세포로 추가적인 연구를 할 수 있으며, 96-well 에서 1,536-well plate의 범위까지 분석할 수 있다.
□ Ready-To-Glow Live Cell Secreted Reporter System
Ready-To-Glow System은 secreted Metridia luciferase reporter에 기반을 두고 있으며, enzyme-based system의 민감성과 live-cell assay의 이점을 결합시킨 제품이다. 세포를 파쇄하지 않고 transfection 된 세포의 상층액으로 분비된 reporter 효소의 활성을 one-step으로 측정함으로써 promoter 활성을 관찰할 수 있다 (Figure 1).Firefly와 Renilla luciferase는 cytosol protein이기 때문에 reporter를 검출하기 위해서는 반드시 세포를 파쇄하고 기질을 첨가하여야 한다. 따라서, timecourse 연구에서는 transfection 된 세포에서 의미 있는 결과를 얻기 위해선 시간 별로 세포를 파쇄해야만 하는 불편함이 있다. 그러나 Ready-to-Glow Luciferase System은 이러한 장애 요소을 제거시켰다.Metridia secreted luciferase는 Renilla와 firefly luciferase와 같이 분비되지 않는 luciferase reporter와 비교하여 기질 첨가 후 signal 강도의 변화 없이 더 높은 signal 안정성을 보였다 (Figure 2). 이것은 한번에 다수의 시료를 다루기 쉽도록 해준다. 또한 signal intensity가 기질 첨가 후 시간에 따라 감소하더라도, 전체적인 발현 배수는 30 분 후에도 같은 상태로 남아있게 된다(Figure 3).재조합 Metridia luciferase 활성은 96-well 형태 (40 fg Metridia luciferase per ml of sample)에서 매우 낮은 검출 한계 (~2 fg per well)를 가지며, 아주 넓은 범위의 농도 (적어도 6 log)에서도 직선적인 결과를 나타낸다. 이 효소의 dynamic rage는 다수의 세포 종류와 plate 형태에서 측정이 되었으며, 희석된 배지 상층액에서 signal은 적어도 4 자리 수 (0.01% ~ 100% ; 2)에 대하여 선형을 나타낸다. Z、값은 0.66이며, 이것은 낮은 가변성과 함께 높은 dynamic range를 대변해 준다. Metridia luciferase는 2% DMSO에서도 안정하다. Hight throughput application을 위한 더 많은 정보가 필요하다면 Clontech website에서 확인할 수 있다.
Figure 1. Flow chart of the Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter System.
Figure 2. High signal intensity and stability using secreted Metridia luciferase. CHO cells were plated into 96-well plates and transiently transfected with CMV-driven constructs encoding non-secreted firefly luciferase, non-secreted Renilla luciferase, and secreted Metridia luciferase. 24 hr after transfection, luciferase activity in equivalent samples was analyzed by addition of the recommended substrate. The signal was measured at different timepoints over a period of 45 min. neg = negative control.
Figure 3. Monitoring promoter activation using the sequence-optimized secreted Metridia luciferase reporter. HeLa cells were transiently transfected with a vector construct containing the NFκB response element driving the expression of sequence-optimized secreted Metridia luciferase. 24 hr after transfection, the media was removed and replaced by media with or without TNF-α (100 ng/ml) to activate the NFκB signal transduction pathway. Six hr after addition of TNF-α, samples of the media were removed and analyzed for Metridia luciferase activity. The fold induction was calculated for different time points following the addition of substrate.
□ Ready-To-Glow Dual Secreted Reporter System
Ready-To-Glow Dual Secreted Reporter System은 Ready-To-Glow Secre ted Luciferase와 secreted alkaline phosphatase (SEAP)의 2 종의 분비형 report로 구성되어 있으며, reporter-specific substrate를 이용하여 측정하고 구별할 수 있다. 두 reporter의 secretion kinetics은 매우 유사 하여 (Figure 4), 세포 배양 배지에서 측정되는 한 reporter의 양은 promoter 활성을 정확하게 반영한다. 이러한 dual-reporter 시스템은 다양한 형태로 두 promoter의 활성 변화를 관찰하도록 해준다 (Figure 5). 하나의 reporter는 transfection 효율을 측정하기 위한 control로 사용하고, 다른 하나는 목적 promoter를 관찰하기 위해 사용할 수 있다.
□ Great EscAPe SEAP Reporter System
Secreted Alkaline Phosphatase (SEAP)은 transfection된 세포에서 RNA 발현 수준에 비례하여 배양 배지로 분비된다 (Figure 5). SEAP assay는 효소 농도의 104 배 범위까지 선형을 이룬다. Clontech은 chemiluminescent와 fluorescent substrate를 모두 제공하며, chemiluminescent assay는 SEAP 단백질 10-13 g 까지도 검출할 수 있다. Fluorescent assay는 firefly luciferase assay 보다 덜 민감하지만, 대부분의 실험에 적합하다.
Figure 4. Similar secretion kinetics of Metridia secreted luciferase and SEAP enable accurate comparisons of promoter activity. HeLa cells were transiently transfected with either pMetLuc-Control or pSEAP-Control in six-well plates. Media samples were collected at each time point and each sample was tested in triplicate.
Figure 5. Monitoring activation of two promoters simultaneously. HEK 293 cells cotransfected with pNFκB-TA-MetLuc and pCRE-SEAP constructs were treated with fresh media alone or with media containing either 1,000 ng/ml TNF-α or 10 μM forskolin. Samples of culture supernatant were collected and assayed 7 hr later.
□ Components & Storage Conditions
각 제품 구성물과 보관조건은 Certificate of Analysis 를 참조하십시오.
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SOSRAS募集系统 (SRS and RRS)Ras信号通路转录旁路（are bypassing the transcriptional readout by using the Ras signalling pathway）酵母细胞哺乳物相似Ras定位质膜通酵母Cdc25或哺乳物Son of sevenless (SOS)脒基交换进行GDP-GTP转换Ras激引发游信号转导途径处描述Y2H系统使用Cdc25-2温度敏型酵母菌株Cdc25-2没性能激Ras信号转导途径导致菌株高温（36 ℃）能通Y2H系统选择性激Ras使其温度敏表型消失
SCINEX-P系统（胞外蛋白间互作筛选）由Urech等于2003发布使我析ER内氧化环境蛋白互作该系统利用酵母未折叠蛋白反应（UPR）信号途径ER错误折叠蛋白积累诱导酵母ER I类跨膜蛋白（Ire1p）形二聚体者诱导Hac1p转录其产物激伴侣转录SCINEX-P系统目蛋白与缺少位于腔内N末端寡聚化结构域Ire1p突变蛋白（ΔIre1p）融合两种杂合蛋白互作引起Ire1p蛋白二聚体重构激UPR游信号转导程检测蛋白互作Hac1p UPR元件引入报告基启Y2H系统功用于析蛋白质二硫键异构酶ERp57与钙联蛋白间（两蛋白都ER折叠）、抗原与抗体间互作
裂化泛素系统由JohnssonVarshavsky于1994设计用于测定细胞质基质蛋白间互作检测；扩展膜蛋白间互作筛选泛素类蛋白于细胞错误折叠蛋白十重要蛋白通与聚泛素蛋白链共价结合标记蛋白酶体降解象该链泛素特异性蛋白酶（USP）首先蛋白降解裂泛素化Y2H技术基于泛素裂两独立片段已研究显示泛素裂N端（Nub）及C端（Cub）并且片段间亲性能自发形与原泛素类似蛋白通Nub（NubG, NubA）点突变（I13G or I13A ）使NubCub自发组装进行
两种突变体两部由于NubG/ACub互作拉足够接近距离才能发效结合重构裂化泛素USPs识别切掉与Cub C端融合报告蛋白初系统使用二氢叶酸原酶作报告基者产物通SDS-PAGE检测由于需要使用免疫共沉淀电泳离阳性克隆鉴定十便
膜反式转录激裂泛素(MbY2H)系统使用工转录（LexA-VP16）作与泛素相连水解报告蛋白析ER膜蛋白间相互作用旦泛素重组LexA-VP16释放核并激报告基转录（HIS3LacZ）种转录激式放蛋白互作反应瞬互作检更敏、更便系统已功用于检测同种类膜蛋白间互作反应裂泛素系统已广泛应用于cDNA文库筛选规模矩阵
近期改进适用于胞质蛋白互作筛选MbY2H系统已发布改进案诱饵载体包括Cub转录并且由于融合ER膜蛋白Ost4p使融合蛋白锚定ER膜图" class="ikqb_img_alink">
主要由于：
①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达
②信号测定自平衡浓度条件进行 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤降低信号强度
③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强者与启DNA结合 三元复合体使其各组结合趋于稳定
④通mRNA产种稳定酶使信号放同 酵母表型 X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏图" class="ikqb_img_alink">
（1）种相互作用否细胞内自发即蛋白细胞命否同间表达且定位同区域
（2）某些蛋白依赖于遍蛋白蛋白酶解途径员具普遍蛋白间相互作用能力
（3）些实际没任何相互作用相同模体（motif）两亲a-螺旋蛋白质间发相互作用十酵母双杂交技术直消除假阳性面断改进并且已取较效〔23〕
酵母双杂交应用遇假阴性现象所谓假阴性即两蛋白本应发相互作用报告基表达或表达程度甚低至于检测〔4〕造假阴性原主要两 面：融合蛋白表达细胞毒性应该选择敏性低菌株或拷贝数低载体二蛋白间相互作用较弱应选择高敏菌株及拷贝载体目前假阴性现象虽实验主要问题应予重视
——酵母双杂交系统的发展和应用
随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。
酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域（activationdomain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码AD的基因和CDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了
酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。
基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECHMATCHMarkerSYSTEM3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响
酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。
参考文献
Analysisofsynphilin-1andsynucleininteractionsbyyeasttwohybridb-galactosidaseliquidassay
MichaelNeystata,et.alNeuroscienceLetters325(2002)119–123
Synphilin-1associateswithalpha-synucleinandpromotestheformationofcytosolicinclusions
Engelender,Set.al.Nat.Genet.,22(1999)110–114.
Analysisoftheinteractionbetweensingle-chainvariablefragmentsandtheirantigeninareducingintracellularenvironmentusingthetwo-hybridsystem
GeertDeJaeger,et.al.FEBSLetters467(2000)316^320
Characterisationofinter-andintra-molecularinteractionsofthedenguevirusRNAdependentRNApolymeraseaspotentialdrugtargets
SubhashG.et.al.Farmaco56(2001)33–36
Constructionofamodularyeasttwo-hybridcDNAlibraryfromhumanESTclonesforthehumangenomeproteinlinkagemap
Shao-bingHua,et.al.Gene215(1998)143–152
DevelopingYeastHybridSystem
ZHANG,et.al.ChineseBulletinofLifeSciences12(2000)34-36
Yeasttwo-hybridsystemanditsapplications
ZHANGxiao-guanget.alChineseBulletinofLifeSciences13(2001)228-231
基因快讯
双杂交系统另重要元件报道株报道株指经改造、含报道基（reporter gene）重组质粒宿主细胞用酵母细胞 酵母细胞作报道株酵母双杂交系统具许优点： 〈1〉 易于转化、便于收扩增质粒〈2〉具直接进行选择标记基特征性报道基〈3〉酵母内源性蛋白易同源于哺乳物蛋白结合激结构域融合基转入表达结合结构域融合基酵母细胞系 蛋白间作用使转录重建导致相邻报道基表达（lacZ） 析蛋白间结合作用
酵母双杂交系统能体内测定蛋白质结合作用 具高度敏性主要由于：①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达②信号测定自平衡浓度条件进行 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤降低信号强度③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强 者与启DNA结合 三元复合体使其各组结合趋于稳定④通mRNA产种稳定酶使信号放同 酵母表型 X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏图" class="ikqb_img_alink">
THEGFPTWO--HHYBRIDYBRIDSYSTEM.pdf(126.79k)
