Pre-made tetracycline regulator (TetR) lentiviral particles expressing sequence verified tetracycline regulator gene under an enhanced EF1a promoter (which is non-tissue, non-cell type specific promoter, not be silenced after long-term culture). A blasticidinantibiotic marker under RSV promoter, allows to select transduced cells for long term expression. See product manual (.pdf).
TetR is used in tetracycline inducible expression. It binds to any inducible promoters that has incorporated its binding sequence to repress target expression. And target expression is induced once tetracycline is added. Tetracycline binds to TetR, which releases TetR from target’s promoter, and starts the transcription. Gentarget’s optional inducible shRNA particles and optional inducible expression particles can be turned into tetracycline inducible system by using TetR expressing particles. By using a different antibiotic marker in TetR particles than that in expression particles, you can select the double transduced cells via double antibiotic selection at the same time. Then, the target’s expression is turned into a tetracycline dose dependent inducible expression.
This is the Neomycin version of TetR particles in DMEM medium with 10% FBS.
Amount: 200ul/per vial, at 1 x 107 IFU/ml.
Cat#: LVP459-Neo
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Agarose-Formaldehyde ElectrophoresisRNA electrophoresis under denaturing conditions in 2.2M formaldehyde is performed according to Maniatis et al., (1982) usin
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年初,27 岁女学霸陆盈盈成为浙大博导一度成为热点,让大众开始关注 80 后博导。不理不知道,一理吓一跳。 80 后的博士生导师都开始登上科研舞台,成为中坚力量。让我们阅完兵,一起来看看那些 80 后博导。陆盈盈个人简介陆盈盈博士,女,特聘研究员。2010 年 6 月毕业于浙江大学化学工程与生物工程学院,获得学士学位,2014 年 6 月获得美国康奈尔大学(Cornell University)
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一 基因组酶切和电泳在200 μl 微量离心管中加入:25 μl DNA样品(约10μg),3μl 限制性内切酶(MBI,10 U/ μl)5 μl 相应的10×buffer,补水到50μl。然后加一滴矿物油覆盖, 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后,取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶
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我要做酵母双杂交,有战友在做吗,交流一下,我的QQ446357706,现在我先把我的资料给大家看看吧,我自己写的程序酵母培养:YPD: 蛋白胨20g ,酵母提取物10g ,琼脂20g葡萄糖20g或灭菌后加入葡萄糖(40% 50ml;过滤除菌/121℃,15min),使终浓度为2%.YPDA: YPD+adenin hemisulfate(0.2% 15ml;对热不稳定,不能高温高压灭菌),使终浓度为0.003%.SD /:(SD /完全,SD /-./././.)无氨基酸酵母 ...
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酵母双杂交实验常见问题分析及处理方法在某些情况下,国产ELISA试剂盒在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp,接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板,在30℃下温浴,直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每块板上的克隆,并收集到一管中,这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。如
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For amplification of cognate sequences from different organisms, or for "evolutionary PCR", one may increase the chances of getting product by designing
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蛋白组学研究是即基因组学研究后的生命科学发展的一个大方向之一。蛋白质的结构和功能最终直接影响着生命活动的变化,基因转录水平
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随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成,基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分,例如:DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。酵母双杂交技术作 ...
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质粒pLexA的筛选标志为HIS3,在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵,Bait)的融合蛋白,该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控,选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。质粒pB42AD的筛选标志为TRP1,在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游,含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E
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上海欧易生物医学科技有限公司在发布的膜体系酵母双杂交文库-欧易生物供应信息,浏览与膜体系酵母双杂交文库-欧易生物相关的产品或在搜索更多与膜体系酵母双杂交文库-欧易生物相关的内容。
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通过DUALmembrane酵母双杂交系统筛选APP互作蛋白 来源: 查看手机网址扫一扫!扫一扫! ...
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双杂交系统建立力于真核物调控转录起始程认识细胞起始基转录需要反式转录激参与80代工作表明转录激结构组件式(modular), 即些往往由两或两相互独立结构域构, 其DNA结合结构域(DNA binding domain简称BD)转录激结构域(activation domain简称AD)转录激发挥功能所必需前者识别DNA特异序列并使转录激结构域定位于所调节基游转录激结构域同转录复合体其作用启所调节基转录两结构域其连接区适部位打 仍具各自功能且同两结构域重建发挥转录激作用酵母双杂交系统利用杂交基通激报道基表达探测蛋白-蛋白相互作用单独BD虽能启结合能激转录同转录激BDAD形杂合蛋白仍具激转录功能酵母细胞Gal4蛋白BD与肠杆菌酸性激结构域B42融合杂合蛋白仍结合Gal4结合位点并激转录主要二类载体: a 含DNA -binding domain载体; b 含DNA-activating domain载体般编码蛋白基融合明确转录调控DNA-结合结构域(GAL4-bd LexA-bd); 另蛋白基融合转录激结构域(GAL4-ad VP16)述二类载体构建融合基 测试蛋白基与结构域基必须阅读框内融合融合基报告株表达 其表达产物定位于核内才能驱报告基转录例GAL4-bd具核定位序列(nuclear-localization sequence) GAL4-ad没 GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆自SV40T-抗原段序列作核定位序列目前研究用binding-domain基:GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制)DNA-bd编码序列用activating-domain基:GAL4(768-881)疱疹病毒VP16编码序列等
双杂交系统另重要元件报道株报道株指经改造、含报道基(reporter gene)重组质粒宿主细胞用酵母细胞 酵母细胞作报道株酵母双杂交系统具许优点: 〈1〉 易于转化、便于收扩增质粒〈2〉具直接进行选择标记基特征性报道基〈3〉酵母内源性蛋白易同源于哺乳物蛋白结合激结构域融合基转入表达结合结构域融合基酵母细胞系 蛋白间作用使转录重建导致相邻报道基表达(lacZ) 析蛋白间结合作用
酵母双杂交系统能体内测定蛋白质结合作用 具高度敏性主要由于:①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达②信号测定自平衡浓度条件进行 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤降低信号强度③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强 者与启DNA结合 三元复合体使其各组结合趋于稳定④通mRNA产种稳定酶使信号放同 酵母表型 X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏图" class="ikqb_img_alink">
需要:酵母双杂交RRS系统
用pGBKT7酵母双杂交系统交换
、酵母双杂交系统:酵母双杂交系统前广泛用于蛋白质相互作用组研究种重要其原理靶蛋白诱饵蛋白特异结合诱饵蛋白结合于报道基启启报道基酵母细胞内表达检测报道基表达产物则说明两者间相互作用反则两者间没相互作用种技术微量化、阵列化则用于规模蛋白质间相互作用研究实际工作根据需要发展单杂交系统、三杂交系统反向杂交系统等Angermayr等设计SOS蛋白介导双杂交系统研究膜蛋白功能丰富酵母双杂交系统功能外酵母双杂交系统作用已扩展至蛋白质鉴定
二、噬菌体展示技术:编码噬菌体外壳蛋白基连接单克隆抗体DNA序列噬菌体表面表达相应单抗再噬菌体柱柱若含目蛋白与相应抗体特异性结合称噬菌体展示技术技术主要用于研究蛋白质间相互作用仅高通量及简便特点具直接基、高选择性筛选复杂混合物、筛选程通适改变条件直接评价相互结合特异性等优点目前用优化噬菌体展示技术已经展示鼠两种特殊细胞系cdna文库并离皮信号传导途径信号
三、等离共振技术:表面等离共振技术(Surface Plasmon ResonanceSPR)已蛋白质相互作用研究新手段原理利用种纳米级薄膜吸附诱饵蛋白待测蛋白与诱饵蛋白结合薄膜共振性质发改变通检测便知两种蛋白结合情况SPR技术优点需标记物或染料反应程实监控测定快速且安全用于检测蛋白核酸及其物间相互作用
四、荧光能量转移技术:荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究间距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合定量获取关物体内蛋白质、脂类、DNA RNA 空信息随着绿色荧光蛋白(GFP)发展FRET 荧光显微镜能实测量体细胞内态性质提种定量测量FRET效率及供体与受体间距离简单仅需使用组滤光片测量比值利用供体受体发射谱消除光谱间串扰该简单快速实定量测量FRET 效率供体与受体间距离尤其适用于基于GFP 供体受体
五、抗体与蛋白质阵列技术:蛋白芯片技术现给蛋白质组研究带新思路蛋白质组研究主要内容研究同理状态蛋白水平量变微型化集化高通量化抗体芯片非研究工具芯片发展快芯片且技术已经益熟些抗体芯片已经向临床应用发展比肿瘤标志物抗体芯片等已经应用再眼各领域
六、免疫共沉淀技术:免疫共沉淀主要用研究蛋白质与蛋白质相互作用种技术其基本原理细胞裂解液加入抗兴趣蛋白抗体孵育再加入与抗体特异结合结合于Pansobin珠金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)若细胞与兴趣蛋白结合目蛋白形种复合物:目蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA|PansobinSPA|Pansobin比较复合物离离经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳复合物四组经Western blotting用抗体检测目蛋白否预测蛋白种目蛋白细胞内与兴趣蛋白结合符合体内实际情况蛋白信度高种两缺陷:两种蛋白质结合能直接结合能第三者间起桥梁作用;二必须实验前预测目蛋白选择检测抗体所若预测确实验结本身具冒险性
七、pull-down技术:蛋白质相互作用类型牢固型相互作用暂型相互作用两种牢固型相互作用亚基蛋白复合体见通免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western研究Pull-down技术用固相化、已标记饵蛋白或标签蛋白(物素-、PolyHis-或GST-)细胞裂解液钓与相互作用蛋白通Pull-down技术确定已知蛋白与钓蛋白或已纯化相关蛋白间相互作用关系体外传路或翻译体系检测蛋白相互作用关系
在传统的酵母
双杂交系统中,蛋白质需要入核发生相互作用,才能激活报道基因表达;因此对于发生在细胞质中或者细胞膜上的蛋白质相互作用是检测不到的。最近几年开发出了一种细胞质的酵母双杂交系统,与传统的基于转录因子GAL4或者LexA的方法不同,细胞质双杂交是在Ras途径的基础上建立的。如StratageneCytoTrapTM双杂交系统。可以参考链接http://www.ebiotrade.com/emgzf/genenews2005/gene26.htm
最近本人在做一个丝氨酸/苏氨酸蛋白
激酶的酵母双杂交,想吊出它的互作基因,前段时间用
Invitrogen的PROQUESTTWO-HYBRIDSYSTEM筛过一次库,没有得到任何阳性克隆,我估计是连入
载体的基因太长有3KB多,1000多个
氨基酸,可能就算表达出来了也不能行使正常功能。随后取了蛋白的激酶区1.8KB,想重新筛一次库(还未开始重筛)。后来老板的建议是要我试试酵母细胞质双杂交系统,因为在生物体内,我所研究的蛋白是在细胞质中表达的,可能在酵母细胞核中也不能正常工作(猜测)。
这两天我查了查,发现细胞质的双杂交完全不同,要是做的话还有重新购买另外的
试剂盒,重新构建
文库。
还有一点就是,前人发表的文章,同样是做我这种蛋白激酶的,都是用传统的酵母双杂交系统筛选到互作蛋白的,如果情况是这样的话我是否还有必要尝试细胞质的双杂交呢?
还是等我做了激酶区的筛库之后再说?
请各位帮忙看看,谢谢。
酵母双杂交系统析蛋白-蛋白间相互作用效快速 面应用 仍存些局限性⑴双杂交系统析蛋白间相互作用定位于细胞核内 许蛋白间相互作用依赖于翻译加工糖基化、二硫键形等 些反应核内进行另外些蛋白确折叠功能赖于其非酵母蛋白辅助 限制某些细胞外蛋白细胞膜受体蛋白等研究⑵酵母双杂交系统重要问题假阳性由于某些蛋白本身具激转录功能或酵母表达发挥转录激作用 使DNA结合结构域杂交蛋白特异激结构域情况激转录另外某些蛋白表面含种蛋白质低亲力区域 能与其蛋白形稳定复合物 引起报告基表达 产假阳性结
本人学生狗,要做
CDNA
文库构建,买了clontech的酵母
双杂交系统但是没有中文说明书,**大神给一个中文的说明书
630489MatchmakerGoldYeastTwo-HybridSystemUs.pdf(1780.44k)
蛋白质与蛋白质间相互作用构细胞化反应网络主要组部蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络调控细胞及其信号重要意义<ul>、酵母双杂交系统:酵母双杂交系统前广泛用于蛋白质相互作用组研究种重要其原理靶蛋白诱饵蛋白特异结合诱饵蛋白结合于报道基启启报道基酵母细胞内表达检测报道基表达产物则说明两者间相互作用反则两者间没相互作用种技术微量化、阵列化则用于规模蛋白质间相互作用研究实际工作根据需要发展单杂交系统、三杂交系统反向杂交系统等Angermayr等设计SOS蛋白介导双杂交系统研究膜蛋白功能丰富酵母双杂交系统功能外酵母双杂交系统作用已扩展至蛋白质鉴定二、噬菌体展示技术:编码噬菌体外壳蛋白基连接单克隆抗体DNA序列噬菌体表面表达相应单抗再噬菌体柱柱若含目蛋白与相应抗体特异性结合称噬菌体展示技术技术主要用于研究蛋白质间相互作用仅高通量及简便特点具直接基、高选择性筛选复杂混合物、筛选程通适改变条件直接评价相互结合特异性等优点目前用优化噬菌体展示技术已经展示鼠两种特殊细胞系cdna文库并离皮信号传导途径信号三、等离共振技术:表面等离共振技术(Surface Plasmon ResonanceSPR)已蛋白质相互作用研究新手段原理利用种纳米级薄膜吸附诱饵蛋白待测蛋白与诱饵蛋白结合薄膜共振性质发改变通检测便知两种蛋白结合情况SPR技术优点需标记物或染料反应程实监控测定快速且安全用于检测蛋白核酸及其物间相互作用四、荧光能量转移技术:荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究间距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合定量获取关物体内蛋白质、脂类、DNA RNA 空信息随着绿色荧光蛋白(GFP)发展FRET 荧光显微镜能实测量体细胞内态性质提种定量测量FRET效率及供体与受体间距离简单仅需使用组滤光片测量比值利用供体受体发射谱消除光谱间串扰该简单快速实定量测量FRET 效率供体与受体间距离尤其适用于基于GFP 供体受体五、抗体与蛋白质阵列技术:蛋白芯片技术现给蛋白质组研究带新思路蛋白质组研究主要内容研究同理状态蛋白水平量变微型化集化高通量化抗体芯片非研究工具芯片发展快芯片且技术已经益熟些抗体芯片已经向临床应用发展比肿瘤标志物抗体芯片等已经应用再眼各领域六、免疫共沉淀技术:免疫共沉淀主要用研究蛋白质与蛋白质相互作用种技术其基本原理细胞裂解液加入抗兴趣蛋白抗体孵育再加入与抗体特异结合结合于Pansobin珠金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)若细胞与兴趣蛋白结合目蛋白形种复合物:目蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPAPansobinSPAPansobin比较复合物离离经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳复合物四组经Western blotting用抗体检测目蛋白否预测蛋白种目蛋白细胞内与兴趣蛋白结合符合体内实际情况蛋白信度高种两缺陷:两种蛋白质结合能直接结合能第三者间起桥梁作用;二必须实验前预测目蛋白选择检测抗体所若预测确实验结本身具冒险性七、pull-down技术:蛋白质相互作用类型牢固型相互作用暂型相互作用两种牢固型相互作用亚基蛋白复合体见通免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western研究Pull-down技术用固相化、已标记饵蛋白或标签蛋白(物素-、PolyHis-或GST-)细胞裂解液钓与相互作用蛋白通Pull-down技术确定已知蛋白与钓蛋白或已纯化相关蛋白间相互作用关系体外传路或翻译体系检测蛋白相互作用关系</ul>
1.待测基与Gal4或LexA或其合适蛋白DNA结合域融合构建诱饵质粒;
2.诱饵质粒转化缺乏报告基启酵母细胞株选择转化酵母;
3.再文库质粒转化酵母;
4.通报告基功能筛选相互作用蛋白图" class="ikqb_img_alink">
酵母双杂交系统能体内测定蛋白质结合作用具高度敏性
主要由于:
①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达
②信号测定自平衡浓度条件进行 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤降低信号强度
③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强者与启DNA结合 三元复合体使其各组结合趋于稳定
④通mRNA产种稳定酶使信号放同 酵母表型 X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏图" class="ikqb_img_alink">
GAL4-LUC双元表达系统和酵母
双杂交系统有什么区别?最近看文献总是遇到这类问题,还有GAL4-LUC双元表达系统好像是用来检测转基因是否转录?对吗?请高手解答!感谢!
希望对从事相关科研工作的朋友有所帮助!
THEGFPTWO--HHYBRIDYBRIDSYSTEM.pdf(126.79k)
transcriptional activation
词典
转录激
双语例句
1
Transcriptional activation and repression regulation in target gene by thyroid hormone receptors
甲状腺激素受体调节靶基转录激抑制作用
2
Objective: To assay the transcriptional activation effect of prohibitin in yeast two hybrid system.
目:检测抗增殖蛋白酵母双杂交系统否具转录自激作用