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我现在正在进行酵母双杂交实验.在做自激活检测时，发现SC-ura-trp-his的平板具有自激活效应，但是选择用SC-ura-trp-ade的平板进行酵母双杂筛选时，由于平板过于严苛，而没能筛选到转化子；现在想用添加3-AT作为抑制剂的SC-ura-trp-his平板进行筛选，现在想请实验高手们给予指导，3-AT的浓度为多少比较适宜？？？谢谢大家！:)

酵母双杂交系统应用遇问题假阳性较二转化效率偏低所谓假阳性：待研究两蛋白间没发相互作用情况报告基激主要原由于BD融合诱饵蛋白单独激作用或者种融合蛋白激作用外蛋白激另外AD融合靶蛋白DNA特异性结合则单独激报告基表达排除假阳性需要作严格照试验应诱饵靶蛋白别作单独激报告基鉴定目前几公司推酵母双杂系统都采用报告基且每报告基游调控区各相同减少量假阳性另外报告基通整合染色体使基表达水平稳定消除由于质粒拷贝数变化引起基表达水平波造假阳性

在传统的酵母双杂交系统中，蛋白质需要入核发生相互作用，才能激活报道基因表达；因此对于发生在细胞质中或者细胞膜上的蛋白质相互作用是检测不到的。最近几年开发出了一种细胞质的酵母双杂交系统，与传统的基于转录因子GAL4或者LexA的方法不同，细胞质双杂交是在Ras途径的基础上建立的。如StratageneCytoTrapTM双杂交系统。可以参考链接http://www.ebiotrade.com/emgzf/genenews2005/gene26.htm

最近本人在做一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的酵母双杂交，想吊出它的互作基因，前段时间用Invitrogen的PROQUESTTWO-HYBRIDSYSTEM筛过一次库，没有得到任何阳性克隆，我估计是连入载体的基因太长有3KB多，1000多个氨基酸，可能就算表达出来了也不能行使正常功能。随后取了蛋白的激酶区1.8KB，想重新筛一次库（还未开始重筛）。后来老板的建议是要我试试酵母细胞质双杂交系统，因为在生物体内，我所研究的蛋白是在细胞质中表达的，可能在酵母细胞核中也不能正常工作（猜测）。
这两天我查了查，发现细胞质的双杂交完全不同，要是做的话还有重新购买另外的试剂盒，重新构建文库。
还有一点就是，前人发表的文章，同样是做我这种蛋白激酶的，都是用传统的酵母双杂交系统筛选到互作蛋白的，如果情况是这样的话我是否还有必要尝试细胞质的双杂交呢？
还是等我做了激酶区的筛库之后再说？
请各位帮忙看看，谢谢。

酵母双杂交x gal培养基加入aba
　　发展起各种双杂交系统Fields等建立系统基础些新系统主要报道基、诱饵表达载体及猎物表达载体等做些改进其重要改进引入额外报道基广泛采用HIS3基经改造带HIS3报道基酵母细胞HIS3启表达才能缺乏组氨酸选择性培养基HIS3报道基转录表达由诱饵猎物相互作用所启数双杂交系统往往同使用两甚至三报道基其 LacZ些改造基启区相同转录激结合位点相同转录激（述Gal4蛋白）激通种双重或重选择既提高检测灵敏度减少假阳性现象其针诱饵或猎物表达载体等所作改进详述
　　双杂交鉴定程要经两转化工作量相特别寻找新作用蛋白质候尤其且酵母细胞转化效率比细菌要低约4数量级转化步骤双杂交技术瓶颈Bendixen等通酵母接合型引用避免两转化操作同提高双杂交效率酵母性殖程涉及两种配合类型：a接合型α接合型两种单倍体间接合（mating）能形二倍体a接合型细胞间或α接合型细胞间能接合形二倍体根据酵母性殖特点文库质粒转化α接合型酵母细胞诱饵表达载体转化a接合型细胞别铺筛选平板使细胞菌苔（lawn）再两种菌苔复印同三重筛选平板原则诱饵靶蛋白发相互作用二倍体细胞才能平板单倍体细胞或虽二倍体细胞BD融合蛋白AD融合蛋白相互作用都淘汰克隆进步通β-半乳糖苷酶力进行鉴定项改进仅简化实验操作且提高双杂交筛选效率

反式转录抑制（RTA）系统与经典Y2H相反诱饵-猎物互作抑制转录激报告基诱饵蛋白X与Gal4DBD融合具转录激性另蛋白Y与种转录阻碍物（Tup1p）抑制结构域（RD）融合两者相互作用报告基转录抑制[60]RTA系统已用于研究哺乳物basic helix-loop-helix proteins MyoDE12、protooncogenic transcription factor c-Myc与the putative tumor suppressor protein Bin1蛋白间相互作用同该系统用于筛选与各种转录激相互作用单纯性疱疹病毒（HSV-1）调控蛋白VP16 [60]c-Myc及雄性激素受体
SOSRAS募集系统 (SRS and RRS)Ras信号通路转录旁路（are bypassing the transcriptional readout by using the Ras signalling pathway）酵母细胞哺乳物相似Ras定位质膜通酵母Cdc25或哺乳物Son of sevenless (SOS)脒基交换进行GDP-GTP转换Ras激引发游信号转导途径处描述Y2H系统使用Cdc25-2温度敏型酵母菌株Cdc25-2没性能激Ras信号转导途径导致菌株高温（36 ℃）能通Y2H系统选择性激Ras使其温度敏表型消失
SCINEX-P系统（胞外蛋白间互作筛选）由Urech等于2003发布使我析ER内氧化环境蛋白互作该系统利用酵母未折叠蛋白反应（UPR）信号途径ER错误折叠蛋白积累诱导酵母ER I类跨膜蛋白（Ire1p）形二聚体者诱导Hac1p转录其产物激伴侣转录SCINEX-P系统目蛋白与缺少位于腔内N末端寡聚化结构域Ire1p突变蛋白（ΔIre1p）融合两种杂合蛋白互作引起Ire1p蛋白二聚体重构激UPR游信号转导程检测蛋白互作Hac1p UPR元件引入报告基启Y2H系统功用于析蛋白质二硫键异构酶ERp57与钙联蛋白间（两蛋白都ER折叠）、抗原与抗体间互作
裂化泛素系统由JohnssonVarshavsky于1994设计用于测定细胞质基质蛋白间互作检测；扩展膜蛋白间互作筛选泛素类蛋白于细胞错误折叠蛋白十重要蛋白通与聚泛素蛋白链共价结合标记蛋白酶体降解象该链泛素特异性蛋白酶（USP）首先蛋白降解裂泛素化Y2H技术基于泛素裂两独立片段已研究显示泛素裂N端（Nub）及C端（Cub）并且片段间亲性能自发形与原泛素类似蛋白通Nub（NubG, NubA）点突变（I13G or I13A ）使NubCub自发组装进行
两种突变体两部由于NubG/ACub互作拉足够接近距离才能发效结合重构裂化泛素USPs识别切掉与Cub C端融合报告蛋白初系统使用二氢叶酸原酶作报告基者产物通SDS-PAGE检测由于需要使用免疫共沉淀电泳离阳性克隆鉴定十便
膜反式转录激裂泛素(MbY2H)系统使用工转录（LexA-VP16）作与泛素相连水解报告蛋白析ER膜蛋白间相互作用旦泛素重组LexA-VP16释放核并激报告基转录（HIS3LacZ）种转录激式放蛋白互作反应瞬互作检更敏、更便系统已功用于检测同种类膜蛋白间互作反应裂泛素系统已广泛应用于cDNA文库筛选规模矩阵
近期改进适用于胞质蛋白互作筛选MbY2H系统已发布改进案诱饵载体包括Cub转录并且由于融合ER膜蛋白Ost4p使融合蛋白锚定ER膜图" class="ikqb_img_alink">

1.待测基与Gal4或LexA或其合适蛋白DNA结合域融合构建诱饵质粒；
2.诱饵质粒转化缺乏报告基启酵母细胞株选择转化酵母；
3.再文库质粒转化酵母；
4.通报告基功能筛选相互作用蛋白图" class="ikqb_img_alink">

研究蛋白质相互作用的技术平台

——酵母双杂交系统的发展和应用

随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。

酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。

酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域（activationdomain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码AD的基因和CDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了

酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。

基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。

1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECHMATCHMarkerSYSTEM3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。

2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。

3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响
酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。

4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。
参考文献
Analysisofsynphilin-1andsynucleininteractionsbyyeasttwohybridb-galactosidaseliquidassay
MichaelNeystata,et.alNeuroscienceLetters325(2002)119–123
Synphilin-1associateswithalpha-synucleinandpromotestheformationofcytosolicinclusions
Engelender,Set.al.Nat.Genet.,22(1999)110–114.
Analysisoftheinteractionbetweensingle-chainvariablefragmentsandtheirantigeninareducingintracellularenvironmentusingthetwo-hybridsystem
GeertDeJaeger,et.al.FEBSLetters467(2000)316^320
Characterisationofinter-andintra-molecularinteractionsofthedenguevirusRNAdependentRNApolymeraseaspotentialdrugtargets
SubhashG.et.al.Farmaco56(2001)33–36
Constructionofamodularyeasttwo-hybridcDNAlibraryfromhumanESTclonesforthehumangenomeproteinlinkagemap
Shao-bingHua,et.al.Gene215(1998)143–152
DevelopingYeastHybridSystem
ZHANG,et.al.ChineseBulletinofLifeSciences12(2000)34-36
Yeasttwo-hybridsystemanditsapplications
ZHANGxiao-guanget.alChineseBulletinofLifeSciences13(2001)228-231

基因快讯

、酵母双杂交系统：酵母双杂交系统前广泛用于蛋白质相互作用组研究种重要其原理靶蛋白诱饵蛋白特异结合诱饵蛋白结合于报道基启启报道基酵母细胞内表达检测报道基表达产物则说明两者间相互作用反则两者间没相互作用种技术微量化、阵列化则用于规模蛋白质间相互作用研究实际工作根据需要发展单杂交系统、三杂交系统反向杂交系统等Angermayr等设计SOS蛋白介导双杂交系统研究膜蛋白功能丰富酵母双杂交系统功能外酵母双杂交系统作用已扩展至蛋白质鉴定
二、噬菌体展示技术：编码噬菌体外壳蛋白基连接单克隆抗体DNA序列噬菌体表面表达相应单抗再噬菌体柱柱若含目蛋白与相应抗体特异性结合称噬菌体展示技术技术主要用于研究蛋白质间相互作用仅高通量及简便特点具直接基、高选择性筛选复杂混合物、筛选程通适改变条件直接评价相互结合特异性等优点目前用优化噬菌体展示技术已经展示鼠两种特殊细胞系cdna文库并离皮信号传导途径信号
三、等离共振技术：表面等离共振技术(Surface Plasmon ResonanceSPR)已蛋白质相互作用研究新手段原理利用种纳米级薄膜吸附诱饵蛋白待测蛋白与诱饵蛋白结合薄膜共振性质发改变通检测便知两种蛋白结合情况SPR技术优点需标记物或染料反应程实监控测定快速且安全用于检测蛋白核酸及其物间相互作用
四、荧光能量转移技术：荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究间距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合定量获取关物体内蛋白质、脂类、DNA RNA 空信息随着绿色荧光蛋白(GFP)发展FRET 荧光显微镜能实测量体细胞内态性质提种定量测量FRET效率及供体与受体间距离简单仅需使用组滤光片测量比值利用供体受体发射谱消除光谱间串扰该简单快速实定量测量FRET 效率供体与受体间距离尤其适用于基于GFP 供体受体
五、抗体与蛋白质阵列技术：蛋白芯片技术现给蛋白质组研究带新思路蛋白质组研究主要内容研究同理状态蛋白水平量变微型化集化高通量化抗体芯片非研究工具芯片发展快芯片且技术已经益熟些抗体芯片已经向临床应用发展比肿瘤标志物抗体芯片等已经应用再眼各领域
六、免疫共沉淀技术：免疫共沉淀主要用研究蛋白质与蛋白质相互作用种技术其基本原理细胞裂解液加入抗兴趣蛋白抗体孵育再加入与抗体特异结合结合于Pansobin珠金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)若细胞与兴趣蛋白结合目蛋白形种复合物：目蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA|PansobinSPA|Pansobin比较复合物离离经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳复合物四组经Western blotting用抗体检测目蛋白否预测蛋白种目蛋白细胞内与兴趣蛋白结合符合体内实际情况蛋白信度高种两缺陷：两种蛋白质结合能直接结合能第三者间起桥梁作用;二必须实验前预测目蛋白选择检测抗体所若预测确实验结本身具冒险性
七、pull-down技术：蛋白质相互作用类型牢固型相互作用暂型相互作用两种牢固型相互作用亚基蛋白复合体见通免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western研究Pull-down技术用固相化、已标记饵蛋白或标签蛋白(物素-、PolyHis-或GST-)细胞裂解液钓与相互作用蛋白通Pull-down技术确定已知蛋白与钓蛋白或已纯化相关蛋白间相互作用关系体外传路或翻译体系检测蛋白相互作用关系

酵母双杂交系统应用遇问题假阳性较二转化效率偏低所谓假阳性：待研究两蛋白间没发相互作用情况报告基激主要原由于BD融合诱饵蛋白单独激作用或者种融合蛋白激作用外蛋白激另外AD融合靶蛋白DNA特异性结合则单独激报告基表达排除假阳性需要作严格照试验应诱饵靶蛋白别作单独激报告基鉴定目前几公司推酵母双杂系统都采用报告基且每报告基游调控区各相同减少量假阳性另外报告基通整合染色体使基表达水平稳定消除由于质粒拷贝数变化引起基表达水平波造假阳性即使根据严格照实验证明确实发蛋白间相互作用应面进行析：
（1）种相互作用否细胞内自发即蛋白细胞命否同间表达且定位同区域
（2）某些蛋白依赖于遍蛋白蛋白酶解途径员具普遍蛋白间相互作用能力
（3）些实际没任何相互作用相同模体（motif）两亲a-螺旋蛋白质间发相互作用十酵母双杂交技术直消除假阳性面断改进并且已取较效〔23〕
酵母双杂交应用遇假阴性现象所谓假阴性即两蛋白本应发相互作用报告基表达或表达程度甚低至于检测〔4〕造假阴性原主要两 面：融合蛋白表达细胞毒性应该选择敏性低菌株或拷贝数低载体二蛋白间相互作用较弱应选择高敏菌株及拷贝载体目前假阴性现象虽实验主要问题应予重视

谢谢!

、酵母双杂交系统：酵母双杂交系统前广泛用于蛋白质相互作用组研究种重要其原理靶蛋白诱饵蛋白特异结合诱饵蛋白结合于报道基启启报道基酵母细胞内表达检测报道基表达产物则说明两者间相互作用反则两者间没相互作用种技术微量化、阵列化则用于规模蛋白质间相互作用研究实际工作根据需要发展单杂交系统、三杂交系统反向杂交系统等Angermayr等设计SOS蛋白介导双杂交系统研究膜蛋白功能丰富酵母双杂交系统功能外酵母双杂交系统作用已扩展至蛋白质鉴定
二、噬菌体展示技术：编码噬菌体外壳蛋白基连接单克隆抗体DNA序列噬菌体表面表达相应单抗再噬菌体柱柱若含目蛋白与相应抗体特异性结合称噬菌体展示技术技术主要用于研究蛋白质间相互作用仅高通量及简便特点具直接基、高选择性筛选复杂混合物、筛选程通适改变条件直接评价相互结合特异性等优点目前用优化噬菌体展示技术已经展示鼠两种特殊细胞系cdna文库并离皮信号传导途径信号
三、等离共振技术：表面等离共振技术(Surface Plasmon ResonanceSPR)已蛋白质相互作用研究新手段原理利用种纳米级薄膜吸附诱饵蛋白待测蛋白与诱饵蛋白结合薄膜共振性质发改变通检测便知两种蛋白结合情况SPR技术优点需标记物或染料反应程实监控测定快速且安全用于检测蛋白核酸及其物间相互作用
四、荧光能量转移技术：荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究间距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合定量获取关物体内蛋白质、脂类、DNA RNA 空信息随着绿色荧光蛋白(GFP)发展FRET 荧光显微镜能实测量体细胞内态性质提种定量测量FRET效率及供体与受体间距离简单仅需使用组滤光片测量比值利用供体受体发射谱消除光谱间串扰该简单快速实定量测量FRET 效率供体与受体间距离尤其适用于基于GFP 供体受体
五、抗体与蛋白质阵列技术：蛋白芯片技术现给蛋白质组研究带新思路蛋白质组研究主要内容研究同理状态蛋白水平量变微型化集化高通量化抗体芯片非研究工具芯片发展快芯片且技术已经益熟些抗体芯片已经向临床应用发展比肿瘤标志物抗体芯片等已经应用再眼各领域
六、免疫共沉淀技术：免疫共沉淀主要用研究蛋白质与蛋白质相互作用种技术其基本原理细胞裂解液加入抗兴趣蛋白抗体孵育再加入与抗体特异结合结合于Pansobin珠金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)若细胞与兴趣蛋白结合目蛋白形种复合物：目蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPAPansobinSPAPansobin比较复合物离离经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳复合物四组经Western blotting用抗体检测目蛋白否预测蛋白种目蛋白细胞内与兴趣蛋白结合符合体内实际情况蛋白信度高种两缺陷：两种蛋白质结合能直接结合能第三者间起桥梁作用;二必须实验前预测目蛋白选择检测抗体所若预测确实验结本身具冒险性
七、pull-down技术：蛋白质相互作用类型牢固型相互作用暂型相互作用两种牢固型相互作用亚基蛋白复合体见通免疫共沉淀(Co-IP) 、Pull-down技术或Far-western研究Pull-down技术用固相化、已标记饵蛋白或标签蛋白(物素-、PolyHis-或GST-)细胞裂解液钓与相互作用蛋白通Pull-down技术确定已知蛋白与钓蛋白或已纯化相关蛋白间相互作用关系体外传路或翻译体系检测蛋白相互作用关系

酵母ah109 ura缺失培养基
　　发展起各种双杂交系统Fields等建立系统基础些新系统主要报道基、诱饵表达载体及猎物表达载体等做些改进其重要改进引入额外报道基广泛采用HIS3基经改造带HIS3报道基酵母细胞HIS3启表达才能缺乏组氨酸选择性培养基HIS3报道基转录表达由诱饵猎物相互作用所启数双杂交系统往往同使用两甚至三报道基其 LacZ些改造基启区相同转录激结合位点相同转录激（述Gal4蛋白）激通种双重或重选择既提高检测灵敏度减少假阳性现象其针诱饵或猎物表达载体等所作改进详述
　　双杂交鉴定程要经两转化工作量相特别寻找新作用蛋白质候尤其且酵母细胞转化效率比细菌要低约4数量级转化步骤双杂交技术瓶颈Bendixen等通酵母接合型引用避免两转化操作同提高双杂交效率酵母性殖程涉及两种配合类型：a接合型α接合型两种单倍体间接合（mating）能形二倍体a接合型细胞间或α接合型细胞间能接合形二倍体根据酵母性殖特点文库质粒转化α接合型酵母细胞诱饵表达载体转化a接合型细胞别铺筛选平板使细胞菌苔（lawn）再两种菌苔复印同三重筛选平板原则诱饵靶蛋白发相互作用二倍体细胞才能平板单倍体细胞或虽二倍体细胞BD融合蛋白AD融合蛋白相互作用都淘汰克隆进步通β-半乳糖苷酶力进行鉴定项改进仅简化实验操作且提高双杂交筛选效率展开