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Pre-made lentiviral particles expressing a fusion target of (GFP-human P53). The sequence verified human P53 gene codon sequence was fusioned at its N-terminal with GFP protein, expressed under a constitutive suCMV promoter, containing a puromycin antibiotic marker under the RSV promoter.
Human P53 (NCBI accession ID:NM_000546) involvs in many signal pathway. The fluorescent labeled P53 can be used to visualize sub-cellular pathway where the P53 bound or targeted at.
Please see product manual for details.
Amount: 200ul/vial (1×108 IFU/ml), provided in DMEM medium with 10% FBS and 60ug/ml Polybrene (10x).
Cat#: LVP448-G
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2019-07-24
上海默玺生物科技有限公司在发布的X-α-Gal 检测双杂交作用 也称X-ALPHA-Gal，或者X-a-gal供应信息，浏览与X-α-Gal 检测双杂交作用 也称X-ALPHA-Gal，或者X-a-gal相关的产品或在搜索更多与X-α-Gal 检测双杂交作用 也称X-ALPHA-Gal，或者X-a-gal相关的内容。 查看更多
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2021-08-24
Prepare a 10ml syringe fitted with a 26G short needle and filled with 5 to 7 ml of medium and 2 to 3 ml of air. Air is important. Prepare a Pasteur pipette wit 查看更多
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2019-01-04
随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。<br> ... 查看更多
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2021-08-17
· Yeast Two-Hybrid System (Finley Lab)This is one of the most comprehensive and detailed guide to yeast two-hybrid system te 查看更多
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法国巴黎Hybrigenics公司ULTImate酵母双杂交互作蛋白筛查服务文库目录， 查看更多
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2021-07-15
BD培养基 酵母双杂交实验常见问题 1.如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？ 在某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下温浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。 查看更多
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2021-08-10
产品信息: 货号 名称 产品形式 规格 储存 ST2202-01 Y2HGold Strain 甘油菌 300l -20℃ 使用说明: 淼灵质粒平台的各批次质粒菌株发货前均经过严格的多重验证,... 查看更多
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2021-08-08
1．Q: 酵母双杂交的筛选流程？A: 将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY质粒，对质粒中的cDNA片段进行测序，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。 2. Q: 酵母杂交技术有哪些优势？A: a．体内的互作验证，省去蛋白表达、纯化等步骤；b. 细胞内验证，在一定程度上反应细胞内的真实情况；c.... 查看更多
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2021-07-16
酵母双杂交服务目前天津赛尔生物可提供适用于浆蛋白、核蛋白及膜蛋白酵母双杂交实验服务的两套系统，可以为客户免费提供配套的人胚脑和人胚肺文库，省去了文库构建的巨大费用，全程服务都会由本公司的酵母双杂交技术专家操作，每位技术专家均有着丰富的酵母双杂交技术服务的经验，可以很好的帮助客户分析并解决在实验过程中遇到的各种问题。 1.技术原理及背景介绍随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，为适应对众多基因或蛋白进行功能研究... 查看更多
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酵母双杂交服务目前天津赛尔生物可提供适用于浆蛋白、核蛋白及膜蛋白酵母双杂交实验服务的两套系统，可以为客户免费提供配套的人胚脑和人胚肺文库，省去了文库构建的巨大费用，全程服务都会由本公司的酵母双杂交技术专家操作，每位技术专家均有着丰富的酵母双杂交技术服务的经验，可以很好的帮助客户分析并解决在实验过程中遇到的各种问题。 1.技术原理及背景介绍随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，为适应对众多基因或蛋白进行功能研究... 查看更多
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2021-09-05
AP Assay and FGF Binding Mike NaskiCOS-7 cells were transfected by a standard DEAE-dextran method with 4 mg of plasmid/10 6 cells. Conditioned medium was harve 查看更多
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2021-07-31
酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质分别克隆（融合）到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域（DNA-BD）和转录激活域（AD）上，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。... 查看更多
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酵母双杂交系统 123
我了个2362017-10-12
酵母双杂交系统能体内测定蛋白质结合作用具高度敏性
主要由于：
①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达
②信号测定自平衡浓度条件进行 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤降低信号强度
③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强者与启DNA结合 三元复合体使其各组结合趋于稳定
④通mRNA产种稳定酶使信号放同 酵母表型 X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏图" class="ikqb_img_alink">
主要由于：
①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达
②信号测定自平衡浓度条件进行 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤降低信号强度
③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强者与启DNA结合 三元复合体使其各组结合趋于稳定
④通mRNA产种稳定酶使信号放同 酵母表型 X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏图" class="ikqb_img_alink">
想知道酵母双杂交到底咋回事啊,看了半天书,晕,希望能用简单明了...123
hwb_bwh2021-08-13
酵母双杂交系统到底是啥回事？有啥用?
clontech公司酵母双杂交试剂盒说明手册123
为爱痴狂74112021-07-29
主要利用两特点：（1）转录具DNA结合结构域即BD；（2）转录具转录激结构域即AD
【求助】求助clontech的酵母双杂交系统中文说明书_问答详情_双...123
蓝天璃2021-08-16
酵母单杂交跟双杂交的区别在哪里?最简单最通俗易懂的说话是什么?123
梓纤矫882017-10-02
酵母双杂交系统析蛋白-蛋白间相互作用效快速 面应用 仍存些局限性⑴双杂交系统析蛋白间相互作用定位于细胞核内 许蛋白间相互作用依赖于翻译加工糖基化、二硫键形等 些反应核内进行另外些蛋白确折叠功能赖于其非酵母蛋白辅助 限制某些细胞外蛋白细胞膜受体蛋白等研究⑵酵母双杂交系统重要问题假阳性由于某些蛋白本身具激转录功能或酵母表达发挥转录激作用 使DNA结合结构域杂交蛋白特异激结构域情况激转录另外某些蛋白表面含种蛋白质低亲力区域 能与其蛋白形稳定复合物 引起报告基表达 产假阳性结
酵母双杂交实验知多少?123
求是寻源2021-07-26
哪位老师使用过cytotrypstratagene双杂交酵母系统啊，我在使用这一系统时，其中的cdc25H酵母菌摇菌时总是突变．哪位老师帮我解答一下，万分感谢！！
酵母双杂交系统技术介绍 123
111222333a2021-07-25
有谁能介绍一下酵母双杂交系统吗？
谢了
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研究蛋白质相互作用的新系统——酵母双杂交系统123
biozy2003-07-22
研究蛋白质相互作用的技术平台
——酵母双杂交系统的发展和应用
随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。
酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域（activationdomain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码AD的基因和CDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了
酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。
基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECHMATCHMarkerSYSTEM3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响
酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。
参考文献
Analysisofsynphilin-1andsynucleininteractionsbyyeasttwohybridb-galactosidaseliquidassay
MichaelNeystata,et.alNeuroscienceLetters325(2002)119–123
Synphilin-1associateswithalpha-synucleinandpromotestheformationofcytosolicinclusions
Engelender,Set.al.Nat.Genet.,22(1999)110–114.
Analysisoftheinteractionbetweensingle-chainvariablefragmentsandtheirantigeninareducingintracellularenvironmentusingthetwo-hybridsystem
GeertDeJaeger,et.al.FEBSLetters467(2000)316^320
Characterisationofinter-andintra-molecularinteractionsofthedenguevirusRNAdependentRNApolymeraseaspotentialdrugtargets
SubhashG.et.al.Farmaco56(2001)33–36
Constructionofamodularyeasttwo-hybridcDNAlibraryfromhumanESTclonesforthehumangenomeproteinlinkagemap
Shao-bingHua,et.al.Gene215(1998)143–152
DevelopingYeastHybridSystem
ZHANG,et.al.ChineseBulletinofLifeSciences12(2000)34-36
Yeasttwo-hybridsystemanditsapplications
ZHANGxiao-guanget.alChineseBulletinofLifeSciences13(2001)228-231
基因快讯
——酵母双杂交系统的发展和应用
随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。
酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域（activationdomain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码AD的基因和CDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了
酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。
基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECHMATCHMarkerSYSTEM3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响
酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。
参考文献
Analysisofsynphilin-1andsynucleininteractionsbyyeasttwohybridb-galactosidaseliquidassay
MichaelNeystata,et.alNeuroscienceLetters325(2002)119–123
Synphilin-1associateswithalpha-synucleinandpromotestheformationofcytosolicinclusions
Engelender,Set.al.Nat.Genet.,22(1999)110–114.
Analysisoftheinteractionbetweensingle-chainvariablefragmentsandtheirantigeninareducingintracellularenvironmentusingthetwo-hybridsystem
GeertDeJaeger,et.al.FEBSLetters467(2000)316^320
Characterisationofinter-andintra-molecularinteractionsofthedenguevirusRNAdependentRNApolymeraseaspotentialdrugtargets
SubhashG.et.al.Farmaco56(2001)33–36
Constructionofamodularyeasttwo-hybridcDNAlibraryfromhumanESTclonesforthehumangenomeproteinlinkagemap
Shao-bingHua,et.al.Gene215(1998)143–152
DevelopingYeastHybridSystem
ZHANG,et.al.ChineseBulletinofLifeSciences12(2000)34-36
Yeasttwo-hybridsystemanditsapplications
ZHANGxiao-guanget.alChineseBulletinofLifeSciences13(2001)228-231
基因快讯
酵母双杂实验操作手册和注意事项123
汉字La2017-10-01
注意事项
（1）酵母双杂交照设定 规酵母双杂交操作般设定阳性照、阴性照及显色系统照三种照MATCHMAKER GAL4酵母双杂交筛选系统例：
阳性照：pGADT7-T + pGBKT7-53其T蛋白53蛋白已经明确酵母细胞内能够发结合并启报告基表达两种蛋白
阴性照：pGADT7-T + pGBKT7-lam其已经明确T蛋白lam蛋白酵母细胞内能发结合 系统显色照pGADT7-Pcl1该表达质粒转入酵母细胞能引起-半乳糖苷酶-半乳糖苷酶泌检测显色系统否问题
（2）假阳性现象种原能造假阳性结见三种：
筛文库蛋白自身具转录性能够启报告基表达——种情况需要筛候选蛋白进行自激验证
酵母细胞内能同含止种文库蛋白其种文库蛋白与诱饵蛋白相互及结合
种情况需要阳性克隆再划板2~3确保每酵母克隆含种文库蛋白诱饵蛋白；另外划板数宜否则现蛋白表达质粒丢失情况 其些明原造假阳性—种情况需要筛候选文库质粒表达诱饵蛋白质粒重新共转入酵母细胞或者通酵母杂交式重新验证必要pGADT7-cDNA质粒与pGBKT7-bait质粒载体调构建pGADT7-bait与pGBKT7-cDNA并重新酵母细胞验证真阳性结合调能酵母细胞做阳性结
（3）见问题及参考案 转化效率低—尽量使用新鲜培养基及新鲜、且直径2~3 mm左右酵母克隆确保酵母力；用于转化质粒使用前进行乙醇沉淀提高质粒纯度浓度
杂交效率偏低—能由于表达融合蛋白酵母细胞毒性某些情况液体培养基酵母换琼脂糖固体培养板比较种情况采用共转化进行试验；或者单转酵母克隆别铺5块10 mm培养板待克隆刮取所克隆于5 mL 0.5×YPDA重悬再按照规杂交操作步骤进行操作 背景高—使用HIS3作报告基由于HIS3基具定程度泄漏表达能现背景高情况使用适量HIS3蛋白竞争性抑制剂3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）降低背景；或者再增加种更加严格报告基筛选Ade
诱饵蛋白具自激现象——采用克隆突变产自激段氨基酸序列敲除或突变种能破坏两蛋白间相互作用
（1）酵母双杂交照设定 规酵母双杂交操作般设定阳性照、阴性照及显色系统照三种照MATCHMAKER GAL4酵母双杂交筛选系统例：
阳性照：pGADT7-T + pGBKT7-53其T蛋白53蛋白已经明确酵母细胞内能够发结合并启报告基表达两种蛋白
阴性照：pGADT7-T + pGBKT7-lam其已经明确T蛋白lam蛋白酵母细胞内能发结合 系统显色照pGADT7-Pcl1该表达质粒转入酵母细胞能引起-半乳糖苷酶-半乳糖苷酶泌检测显色系统否问题
（2）假阳性现象种原能造假阳性结见三种：
筛文库蛋白自身具转录性能够启报告基表达——种情况需要筛候选蛋白进行自激验证
酵母细胞内能同含止种文库蛋白其种文库蛋白与诱饵蛋白相互及结合
种情况需要阳性克隆再划板2~3确保每酵母克隆含种文库蛋白诱饵蛋白；另外划板数宜否则现蛋白表达质粒丢失情况 其些明原造假阳性—种情况需要筛候选文库质粒表达诱饵蛋白质粒重新共转入酵母细胞或者通酵母杂交式重新验证必要pGADT7-cDNA质粒与pGBKT7-bait质粒载体调构建pGADT7-bait与pGBKT7-cDNA并重新酵母细胞验证真阳性结合调能酵母细胞做阳性结
（3）见问题及参考案 转化效率低—尽量使用新鲜培养基及新鲜、且直径2~3 mm左右酵母克隆确保酵母力；用于转化质粒使用前进行乙醇沉淀提高质粒纯度浓度
杂交效率偏低—能由于表达融合蛋白酵母细胞毒性某些情况液体培养基酵母换琼脂糖固体培养板比较种情况采用共转化进行试验；或者单转酵母克隆别铺5块10 mm培养板待克隆刮取所克隆于5 mL 0.5×YPDA重悬再按照规杂交操作步骤进行操作 背景高—使用HIS3作报告基由于HIS3基具定程度泄漏表达能现背景高情况使用适量HIS3蛋白竞争性抑制剂3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）降低背景；或者再增加种更加严格报告基筛选Ade
诱饵蛋白具自激现象——采用克隆突变产自激段氨基酸序列敲除或突变种能破坏两蛋白间相互作用
酵母双杂交123
妹纸我恨你1912017-10-01
酵母双杂交系统由 FieldsSong等首先研究真核基转录调控建立 i .典型真核转录, GAL4、GCN4、等都含二同结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)转录激结构域(transcription-activating domain).前者识别DNA特异序列, 并使转录激结构域定位于所调节基游, 转录激结构域同转录复合体其作用, 启所调节基转录. 二结构域其连接区适部位打, 仍具各自功能.且同两结构域重建发挥转录激作用.酵母双杂交系统利用杂交基通激报道基表达探测蛋白－蛋白相互作用.主要二类载体: a 含DNA -binding domain载体; b 含DNA-activating domain载体.述二类载体构建融合基, 测试蛋白基与结构域基必须阅读框内融合.融合基报告株表达, 其表达产物定位于核内才能驱报告基转录.例GAL4-bd具核定位序列(nuclear-localization sequenc [利用酵母双杂交筛选基] 利用酵母双杂交筛选基 e), GAL4-ad没., GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆自SV40T-抗原段序列作核定位序列.目前研究用binding-domain基： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制)DNA-bd编码序列.用activating-domain基： GAL4(768-881)疱疹病毒VP16编码序列等. 双杂交系统另重要元件报道株.报道株指经改造、含报道基(reporter gene)重组质粒宿主细胞.用酵母细胞, 酵母细胞作报道株酵母双杂交系统具许优点: 〈1〉 易于转化、便于收扩增质粒.〈2〉具直接进行选择标记基特征性报道基.〈3〉酵母内源性蛋白易同源于哺乳物蛋白结合.般编码蛋白基融合明确转录调控DNA－结合结构域(GAL4-bd, LexA-bd)； 另基融合转录激结构域(GAL4-ad, VP16).激结构域融合基转入表达结合结构域融合基酵母细胞系, 蛋白间作用使转录重建导致相邻报道基表达(lacZ), 析蛋白间结合作用. 酵母双杂交系统能体内测定蛋白质结合作用, 具高度敏性.主要由于：①采用高拷贝强启表达载体使杂合蛋白量表达.②信号测定自平衡浓度条件进行, 免疫共沉淀等物理达条件需进行洗涤,降低信号强度.③杂交蛋白间稳定度激结构域结合结构域结合形转录起始复合物增强, 者与启DNA结合, 三元复合体使其各组结合趋于稳定.④通mRNA产种稳定酶使信号放. 同, 酵母表型, X-Gal及HIS3蛋白表达等检测均敏.
蛋白质组学及其主要研究方法 123
佳伟哦472017-10-02
探究物进程机制,需要确定介导程蛋白质-蛋白质间相互作用.研究蛋白质间相互作用主要技术总结：、酵母双杂交系统酵母双杂交系统前广泛用于蛋白质相互作用组研究种重要.其原理靶蛋白诱饵蛋白特异结合,诱饵蛋白结合于报道基启,启报道 基酵母细胞内表达,检测报道基表达产物,则说明两者间相互作用,反则两者间没相互作用.种技术微量化、阵列化则用于 规模蛋白质间相互作用研究.实际工作,根据需要发展单杂交系统、三杂交系统反向杂交系统等.Angermayr等设计SOS蛋白介 导双杂交系统.研究膜蛋白功能,丰富酵母双杂交系统功能.外,酵母双杂交系统作用已扩展至蛋白质鉴定.二、噬茵体展示技术编码噬菌体外壳蛋白基连接单克隆抗体DNA序列,噬菌体,表面表达相应单抗,再噬菌体柱,柱若含目蛋白,与相应抗体 特异性结合,称噬菌体展示技术.技术主要用于研究蛋白质间相互作用,仅高通量及简便特点,具直接基、高选择性筛选复杂混 合物、筛选程通适改变条件直接评价相互结合特异性等优点.目前,用优化噬菌体展示技术,已经展示鼠两种特殊细胞系cDNA文 库,并离皮信号传导途径信号.三、等离共振技术表 面等离共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)已蛋白质相互作用研究新手段.原理利用种纳米级薄膜吸附诱饵蛋白,待测蛋白与诱饵蛋白结合,薄 膜共振性质发改变,通检测便知两种蛋白结合情况.SPR技术优点需标记物或染料,反应程实监控.测定快速且安全,用于检测 蛋白核酸及其物间相互作用.………………展开
酵母选择营养缺陷培养基SD培养基SCDropout/SCUra培养基酵母营养缺 ...123
XD54EN2017-10-02
酵母ah109 ura缺失培养基
发展起各种双杂交系统Fields等建立系统基础些新系统主要报道基、诱饵表达载体及猎物表达载体等做些改进其重要改进引入额外报道基广泛采用HIS3基经改造带HIS3报道基酵母细胞HIS3启表达才能缺乏组氨酸选择性培养基HIS3报道基转录表达由诱饵猎物相互作用所启数双杂交系统往往同使用两甚至三报道基其 LacZ些改造基启区相同转录激结合位点相同转录激（述Gal4蛋白）激通种双重或重选择既提高检测灵敏度减少假阳性现象其针诱饵或猎物表达载体等所作改进详述
双杂交鉴定程要经两转化工作量相特别寻找新作用蛋白质候尤其且酵母细胞转化效率比细菌要低约4数量级转化步骤双杂交技术瓶颈Bendixen等通酵母接合型引用避免两转化操作同提高双杂交效率酵母性殖程涉及两种配合类型：a接合型α接合型两种单倍体间接合（mating）能形二倍体a接合型细胞间或α接合型细胞间能接合形二倍体根据酵母性殖特点文库质粒转化α接合型酵母细胞诱饵表达载体转化a接合型细胞别铺筛选平板使细胞菌苔（lawn）再两种菌苔复印同三重筛选平板原则诱饵靶蛋白发相互作用二倍体细胞才能平板单倍体细胞或虽二倍体细胞BD融合蛋白AD融合蛋白相互作用都淘汰克隆进步通β-半乳糖苷酶力进行鉴定项改进仅简化实验操作且提高双杂交筛选效率展开
发展起各种双杂交系统Fields等建立系统基础些新系统主要报道基、诱饵表达载体及猎物表达载体等做些改进其重要改进引入额外报道基广泛采用HIS3基经改造带HIS3报道基酵母细胞HIS3启表达才能缺乏组氨酸选择性培养基HIS3报道基转录表达由诱饵猎物相互作用所启数双杂交系统往往同使用两甚至三报道基其 LacZ些改造基启区相同转录激结合位点相同转录激（述Gal4蛋白）激通种双重或重选择既提高检测灵敏度减少假阳性现象其针诱饵或猎物表达载体等所作改进详述
双杂交鉴定程要经两转化工作量相特别寻找新作用蛋白质候尤其且酵母细胞转化效率比细菌要低约4数量级转化步骤双杂交技术瓶颈Bendixen等通酵母接合型引用避免两转化操作同提高双杂交效率酵母性殖程涉及两种配合类型：a接合型α接合型两种单倍体间接合（mating）能形二倍体a接合型细胞间或α接合型细胞间能接合形二倍体根据酵母性殖特点文库质粒转化α接合型酵母细胞诱饵表达载体转化a接合型细胞别铺筛选平板使细胞菌苔（lawn）再两种菌苔复印同三重筛选平板原则诱饵靶蛋白发相互作用二倍体细胞才能平板单倍体细胞或虽二倍体细胞BD融合蛋白AD融合蛋白相互作用都淘汰克隆进步通β-半乳糖苷酶力进行鉴定项改进仅简化实验操作且提高双杂交筛选效率展开
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