PCR扩增实验操作步骤
| 试剂、试剂盒 | dNTP混合物基因特异的正向引物基因特异的反向引物单链CDNATaqDNA聚合酶RT-PCR缓冲液 仪器、耗材 | PCR仪PCR管 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液、溶液和试剂 去除RNA酶的双蒸水 10XRT-PCR缓冲液（100mmol/LTris-HCl、pH8.3,500mmol/LKC1，15mmol/LMgCl2) 2.酶和酶缓冲液 TaqDNA聚合酶（5U/ul) 3.核酸和寡核苷酸 dNTP混合物（10mmol/L，包含所有四种dNTP) 基因特异的正向引物（5umol/L) 基因特异的反向引物（5umol/L) 单链cDNA(见第一部分） 4.放射性复合物 [a-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37GBq) 5.实验器材 薄壁的PCR管 6.专用仪器 可编程的PCR仪 二、方法 1.准备PCR反应混合物。 由第一部分制得的cDNA 11ul 10XRT-PCR缓冲液 55ul 10mmol/LdNTP混合物 44ul 5umol/L基因特异的正向引物 22ul 5umol/L基因特异的反向引物 22ul 5U/ulTaqDNA聚合酶 2.75ul 去除RNA酶的双蒸水 387.75ul [a-32P]dCTP(10uCi/ul) 5.5ul 2.平均50ulPCR反应混合物分别放入10个薄壁PCR管中。 3.带有热盖的适当的PCR仪（如：GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBioSystems) 上运行PCR。PCR扩增的循环参数如下。 94°C30s 退火温度30s 72°C30s 35个循环 4.每次奇数脉冲循环后放在冰上取样，由第15个循环起始，到第35个循环终止。 5.变性聚丙烯酰胺凝肢（6%丙烯酰胺/8mol/L尿素）上分析样品。每个样品上样 10ul。滤纸上干燥凝肢，用Phosphorlmager或X射线片和densitometer对产物定量，也可以将产物条带从凝胶上切下，通过闪烁记数仪定量。 6.信号的对数（y轴）对应循环数（x轴）作图。选择处于线性范围中心的循环数在后 续实验中使用。 |
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发布于 ： 2021-09-04
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