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取对数生长期的细胞,按1X106个/mL以1mL体积接种于6孔板内。培养24h后,加入不同浓度样品。在37 ℃、5 % 的CO2恒温箱中培养24h后终止。
(2)细胞固定
胰酶消化并离心收集细胞(800rpm/min),弃上清,用预冷PBS洗细胞两次,加入预冷70%乙醇, -20℃固定保存。
(3) 细胞染色
离心收集细胞(800rpm/min),以1mL的PBS洗细胞一次,加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭(PI),100ug/mL RNase A, 4℃避光孵育20分钟。
(4)检测
以标准程序用流式细胞仪检测,汞激发波长488nm,计数8千个细胞,结果用软件WinMDI Version 2.9分析。
培养一段时间后(一般小于一个细胞周期),固定细胞。根据所使用模拟核苷酸的不同,使用不同的方法。EdU,改变缓冲液的pH值,就会发出荧光。而BrdU则需用荧光抗体识别,需要对细胞膜和核膜进行通透处理。
再加入PI对DNA染色。
在二维坐标图上,横坐标设为线性PI荧光强度,纵坐标设为模拟核苷酸的荧光强度(log)。
典型的图就像下面一样:
G1, G2 和S期就按照图中的划分来做。G1期的细胞没有新合成DNA,所以BrdU信号是阴性,而PI的信号位于1倍体期。S期是正在合成DNA,所以BrdU都是阳性。G2期是已经合成好了2倍的DNA,所以位于2倍体期,信号是G1期的一倍。这个图中,G1 PI信号是300, G2就是600.
过表达质粒转染细胞,以空载质粒做对照,48h后检测对凋亡的影响。请问定象限的时候是用空载质粒的对照组,还是需要用未转染的正常细胞?
2、流式细胞仪(Flow cytometry )是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器,它只能测量一个细胞的诸如总核酸量,总蛋白量等指标,而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说,它的细节 分辨率为零。
最近刚开始做实验,想用双染法流式细胞仪检测不同浓度药物对肿瘤细胞凋亡的影响
按照要求检测时设置如下组别:
1.阴性对照组不染
2.补偿1组AV单染
3.补偿2组PI单染
4.无药物处理组双染
5.药物浓度A组双染
6.药物浓度B组双染
那请问1.2.3组的细胞来源是什么?有前辈说应该是4.5.6三组的混合细胞,请问是这样吗?还是用4.组的即可?
另外还有几个小问题:
1.如果检测当天机器坏了,我在哪一步可以用什么固定来推迟检测?听说可以用PFA,多少浓度的?需固定多长时间?多长时间内检测有效?
2.检测前需要在冰上操作吗?
3.对于贴壁细胞,用胰酶消化后,是先吸除胰酶再加培养液,还是消化后直接加培养液?因为感觉吸除胰酶时会不会不小心吸掉一部分细胞?(碧云天的试剂盒的说明书也不一样,AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒说需吸除胰酶,但细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒中说直接加培养液)
比如白血病,骨髓瘤,艾滋病治疗的监测(看CD4细胞的水平)等等。
流失细胞仪检测细胞数量,可能会出现红色的结果吗?
类似于天文学上观察星星。光线从星球的背后照射过来。FSC看的是激光照射细胞后,从四周散发的光线,越大的细胞光晕越大。信号也越强
而一些老式 的机器,由于装备的激光数量和检测器都很有限,比如BD calibur这款机器。最高配置也就是蓝色(488nm)和红色(647nm)两种激光。检测4种颜色(通道)。所以为方便起见,就命名为FL1,FL2, FL3和FL4。前三种由于蓝色激光,FL4用于检测红色激光所激发的荧光。其中FL1是检测绿色荧光的(比如FITC,荧光素或者绿色荧光蛋白),而FL2是检测橙色荧光的(比如PI染色)。

