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제품특징
□ 특징
● The Cas9 protein solution is sterile and well-tolerated by mammalian cells
● Highly efficient editing when combined with Guide-it Complete sgRNA Screening System (Code 632636)
● Minimizes off-target effects-better than plasmid-based delivery systems
● Works well in hard-to-transfect cell lines
□ 제품설명
Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)은 Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 재조합 단백질로써 CRISPR/Cas9 gene editing 실험에사용할 수 있도록 C-terminal nuclear-localization signal (NLS) 변형이되어 있다. Cas9-sgRNA ribonucleoprotein(RNP) 복합체의 electroporation은 빠른 시간 내 gene editing이가능하도록 하며, 또한 off-target effect를최소화 할 수 있다. 본 제품은 Transfection 시약에 의한 RNP delivery에도 적용가능하며, 이 경우 Mirus의 TransIT-X2 Dynamic DeliverySystem (Code MIR 6000) 사용을추천한다 (그림 4. 참조)
그림 1. Gene knockouts in theCellartis hiPSC-18 cell line. Thestrength of the cleaved bands gives a semiquantitive estimate of the percentageof edited cells. As can be seen, the Guide-it recombinant Cas9, when combinedwith sgRNA from the Guide-it In Vitro Transcription Kit,provides consistent and effective gene editing for many targets. Numbers at thebottom of each gel represent gene editing efficiencies (expressed as a %) forthe indicated RNPs.
그림 2. Homology-directed repair at theAAVS1 or CXCR4 genes. A template containing aHindIII restriction site was inserted into the AAVS1 gene, and a templatecontaining both a HindIII and a BamHI restrictrion site was inserted into theCXCR4 gene. Gene targets were then amplified from target cells using PCR andanalyzed by restriction digest. Editing efficiencies are shown above each positive well on the gel. The extra band in the BamHI digest of the CXCR4 geneis due to a second BamHI site already present in the wild-type gene beforeediting.
그림 3. Guide-it™ RecombinantCas9 (Electroporation-Ready)과 타사 Cas9 단백질의 Konck-out 효율비교 Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)과 타사의 Cas9protein을 이용하여, Human iPS cell에서 CD81 유전자를 타겟하는 sgRNA-Cas9 RNP 복합체를 Neon Transfection System (Thermo Fisher Scientific)으로 Electroporation 도입하였다. 그 결과, 타사의 Cas9 단백질에 비하여 월등히 높은 Knock-out 효율을 얻을 수 있었다 (자사 실험데이터, n=2x3 times) 
그림 4. Guide-it™Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready)와 TransIT-X2를이용한 iPS cell gene editing PPIB (Cyclophili B)에 대한 2개의 guide RNA (gRNA)와 Cas9 protein (타사 제품 또는 Guide-it RecombinantCas9 protein) 복합체 (RNP)를 형성하였다.그 후, RNP 복합체를 TransIT-X2 Dynamic DeliverySystem (Code MIR 6000) (1㎕/well 첨가, 24-wellplate, Mirus Bio) 를 이용하여 iPS cell (KOLF-2, WellcomeTrust Sanger Institute)에 Transfection 방식으로 도입하였다. 여러 농도의 guide RNA를 조합한 RNP 복합체 도입 후, T7E1 mismatch detection으로절단 효율을 확인한 결과 타사 제품 대비하여 보다 높은 절단효율을 확인할 수 있었다.
□ 관련 제품
Guide-itComplete sgRNA Screening System (Code 632636)- Gene delivery에적용가능한 10-20ug의 고수율, 고순도 sgRNA 합성- sgRNAcandidates 중 가장 editing 효율이 높은sgRNA 스크리닝TransIT-X2 Dynamic Delivery System (Code MIR 6000)- DNA, siRNA, miRNA 각각 또는 Co-transfection 가능한 만능 Transfection 시약 - CRISPR/Cas9을 위한 sgRNA-Cas9 RNP delivery에도 효율적
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培养一段时间后（一般小于一个细胞周期），固定细胞。根据所使用模拟核苷酸的不同，使用不同的方法。EdU，改变缓冲液的pH值，就会发出荧光。而BrdU则需用荧光抗体识别，需要对细胞膜和核膜进行通透处理。
再加入PI对DNA染色。
在二维坐标图上，横坐标设为线性PI荧光强度，纵坐标设为模拟核苷酸的荧光强度（log）。
典型的图就像下面一样：
G1, G2 和S期就按照图中的划分来做。G1期的细胞没有新合成DNA，所以BrdU信号是阴性，而PI的信号位于1倍体期。S期是正在合成DNA，所以BrdU都是阳性。G2期是已经合成好了2倍的DNA，所以位于2倍体期，信号是G1期的一倍。这个图中，G1 PI信号是300， G2就是600.
流式细胞仪（Flow cytometry ）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。
染色的各种染料，标记好的荧光抗体染色所需要的缓冲液，封闭液，PBS最终由于上样的缓冲液
不过还要考虑很多因素：标记的方法会不会影响细胞下面的培养细胞是否能够耐受长时间接触房间中的氧气和二氧化碳的浓度机器的无菌情况
（溶血）：红细胞，血红蛋白分解，红细胞溶解逃逸所述，称为溶血。通过各种物理和化学因素和毒素。在体外，如低渗溶液中，强烈的机械振荡，突然冷冻（-20℃-25℃）或突然化冻，过酸或过碱，以及乙醇，乙醚，皂碱，胆碱盐可引起溶血。人血浆的等渗溶液为0.9％NaCl溶液，红细胞在低于0.45％的NaCl溶液中，由于水的渗透，肿胀和红细胞破裂，血红蛋白逸出。在体内，溶血溶血性细菌侵入或某些毒素的抗原 - 抗体反应（如输入配血不合的血液），各种机械性损伤，红细胞内在（膜，酶）引起某些药物的缺陷。溶血性细菌，如某些溶血性链球菌和产气荚膜梭菌可导致败血症。的红血细胞和某些溶血性毒液含酶卵磷脂，卵磷脂血浆或红细胞成溶血卵磷脂，使红细胞膜分解疟原虫破坏。
比较常用的是用计数微球。比如临床上的CD4细胞绝对计数，就是采用这个方法。试管内事先已经有固定数目的计数微球和染色抗体。按要求加入固定体积的抗凝血液，裂解红细胞后上机。记录一千个微球，同时就会得到不同染色区域细胞的数量。这样就可以算出单位体积血液内CD4细胞的绝对数目了。
这样的计数微球也可以另外购买。浓度是固定的。在你已知体积的细胞悬液中加入一定体积的微球后上机，记录一千个微球的数据，细胞的计数也会同时记录。根据微球的浓度就可以推算出细胞的浓度，从而得出绝对计数了
另外一个方法是有些流式细胞仪是使用微泵加样，而不是连续吸取样本，这样样本的体积是已知的，记录一次就是所有样本的数量，可以算出细胞浓度
