E. coli Topoisomerase IV
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E. coli Topoisomerase IV
Topo IV (from Escherichia coli) is prepared by overexpressing the parC and parE subunits in E. coli and purifying them by methods adapted from Peng and Marians, 19991.
The parC and parE subunits are purified to >95% purity as judged by SDS-PAGE. The topo IV is supplied as a heterotetramer complex in Dilution buffer.
It is recommended that the enzyme is aliquoted to avoid repeated freeze-thaw cycles. Store at -80ºC.
All enzyme is supplied with 5X concentrated Assay Buffer and Dilution buffers which are also available separately.
See technical documents below for more detailed information and lot specific activities.
Technical Documents
E. coli Topoisomerase IV Relaxation Assay Kits
These contain the enzyme and the supercoiled DNA substrate in addition to the Assay and Dilution buffers for relaxation reactions. 1 U of topo IV will relax 0.5 µg supercoiled pBR322 DNA in 30 minutes at 37°C.
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E. coli Topoisomerase IV DecatenationAssay Kits
These contain the enzyme and the catenated kDNA substrate in addition to the Assay and Dilution buffers for decatenation reactions. 1 U of topo IV will decatenate 200 ng of kDNA when incubated in 1X Assay buffer in a total reaction volume of 30 µl at 37°C for 30 minutes.
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E. coli Topoisomerase IV Assay Kits for Cell Extracts
These kits are designed for assaying cell extracts and partially purified fractions containing over-expressed topo IV and contain supercoiled DNA substrate, Assay buffer, Dilution buffer, control relaxed DNA and stop buffer/loading dye.
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E. coli Topoisomerase IV Cleavage Assay Kits
These kits are designed specifically for cleavage reactions. They contain topo IV enzyme, supercoiled pBR322 DNA substrate and the Assay and Dilution buffers required for DNA cleavage reactions in addition to the enzyme and linearised pBR322 marker.
Cleavage specific enzyme available separately on request.
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E.coli Topoisomerase IV ATPase kits
These kits can be used to test the effects of potential ATPase inhibitors. For example, the coumarin drugs such as novobiocin inhibit the action of topoisomerase IV by competitively inhibiting the hydrolysis of ATP thus preventing supercoiling.
These assays are microtitre plate-based and thus large numbers of compounds can be screened in a relatively short period of time. They also continuous assays which can provide more information than an end point assay.
Technical Documents
High / Medium-Throughput Assay Kit - E. coli Topoisomerase IV
The kit is supplied with sufficient E. coli topo IV enzyme, plasmid DNA substrate, buffers and other assay components* for 100 assays. The enzyme is supplied at a concentration of 10 U/μl in Dilution Buffer. The kit is also supplied with sufficient wash buffers for one 96-well plate. These buffers are supplied as 20X concentrates and must be diluted with ultra pure water prior to use.
More information about this assay can be found on the "Services" page under "High/Medium Throughput Assay".
Kit issued with limited licence for individual use only.
Patent held by Inspiralis Ltd., Norwich, Norfolk, UK. (Patent No. GB0424953.8, US7838230)
Technical Documents
References
- Peng, H. and Marians, K.J. (1999) Overexpression and purification of bacterial topoisomerase IV, in DNA Topoisomerase Protocols Vol. I (Bjornsti, M-A., and Osheroff, N. eds.), Humana Press, Totowa, N.Jersey pp.163-169
- Maxwell, A., Burton, N.P. and O"Hagan, N. (2006) High-throughput assays for DNA gyrase and other topoisomerases. Nucleic Acid Res. 34 (15), e104
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在双报告基因系统中，通常一个报告基因用于检测特定实验条件下待测物的反应，即“实验”reporter，另一个报告基因用来检测实验条件，类似于内部对照，用于校准“实验”reporter的数据。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，例如：转染效率、细胞活性、细胞裂解差异以及加样操作过程中引起的差异。Promega公司的Dual-Luciferase系统利用萤火虫和海肾荧光素酶的活性分别检测实验组和对照组。萤火虫荧光素酶是一种分子量为61KD的单体酶，分两步催化虫荧光素的氧化反应，产生560nm的光，海肾荧光素酶是一种分子量为36KD的单体酶，催化海肾荧光素的氧化反应，产生中心波长为480nm的蓝光。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶没有种源同源性，对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。
酶标仪有单波长和双波长检测功能有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630 nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。630 nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。
进口酶标仪，伯乐（Bio-Rad）、赛默飞（Thermo Fisher）、帝肯（Tecan）、美谷分子（Molecular Devices）等都有不同的型号可以满足科研需求的
我需要做pcr，做之前用酶标仪测定同一管dna浓度时，数字相差很大，有100度的也有五六十的，这是正常现象么，因为要做正交实验，需要准确的浓度，这种状况，我应该怎么确定浓度呢？求助求助！！
这是一种极具生命力的免疫学技术。
可用于单克隆抗体筛分、凝血分、抗生素灵敏度检验，以及其它需要进行比色的分析工作中。
该仪器适用于临床检验、微生物学、流行病学、免疫学、内分泌学以及农林科学等领域。
广泛用于医院、血站、防疫站、生物制品等部门。
国卫生行政主管部门已明确规定，对多发常见的肝炎病诊断，不能用目测进行，必须用酶标仪判断。
没有酶标仪或不用酶标仪的医院不能上等级，也没有判断肝炎的资格和权利。
对于有蔓延趋势的艾滋病毒的判断，必须建立专门的艾滋病实验室并采用酶标仪进行判断。
分类
酶标仪是实验室常用的一种仪器，一般可以按照滤光方式的不同和功能的不同进行划分。
一。
按照功能的划分，酶标仪可以分为光吸收酶标仪，荧光酶标仪，化学发光酶标仪和多功能的酶标仪。
光吸收酶标仪是用来进行可见光与紫外光吸光度的检测。
特定波长的光通过微孔板中的样品后，光能量被吸收，而被吸收的光能量与样品的浓度呈一定的比例关系，由此可以用来定性和定量的检测。
光吸收的检测技术成熟，成本低，操作简单，但是动态范围窄，灵敏度比较低，特异性不强。
一般可见光和紫外光分别采用钨灯及氘灯作为光源，而紫外/可见酶标仪是可以将两种光源进行切换，适应不同测量波长的需求。
荧光酶标仪是用来进行荧光的检测。
通过激发光栅分光后的特定波长的光照射到被荧光物质标定的样品上后，会发出波长更长的发射光，通过发射光栅后到达检测器。
荧光的强度与样品的浓度呈一定的比例。
荧光检测灵敏度高，可实时检测，使用方便，检测模式多样，但是容易受外界干扰，激发光与发射光容易互相影响，干扰检测。
化学发光是来自生物化学反应中的自发光，可分为辉光型和闪光型两种类型。
辉光型发光持久，稳定，能持续一段时间；
闪光型发光时间短，变化快，稳定性不强，需要应用自动加样器才可以进行。
化学发光中发出的光子数与样品量呈一定比例关系，化学发光酶标仪灵敏度非常高，动力学范围广。
多功能酶标仪是以上三种酶标仪的集合，比如BioTek的Synergy H1/H4,它集成了两种或者三种酶标仪于一体，可以同时进行光吸收，荧光和化学发光的检测，功能强大，使用范围广，可作为研究平台，避免了重复购买，是实验室的首选。
二。
酶标仪基于滤光方式的不同可分为滤光片式的酶标仪和光栅式酶标仪。
滤光片式酶标仪采用滤光片来进行波长的选择，酶标仪内置滤光片轮，可选择试验所需的不同波长的滤光片来进行分光，光源发出的全波谱光经过滤光片后，大部分被过滤，只剩下滤光片本身允许的波长通过，这样就可就通过滤光片来获得特定的波长。
滤光片轮一般包含4-6块滤光片，通过选择不同的滤光片可获得不同的波长，但是获得的波长都是固定的，受到一定的限制，不能获得任意所需的波长，而且更换滤光片价格比较昂贵。
一般波长固定的滤光片有405，450，490，630nm。
光栅式酶标仪虽然才出现短短十余年，但是发展非常迅猛，现在已经是主流的酶标仪。
比如BioTek的Synergy Mx/H1m,它采用光栅进行分光，光源发出的全波谱光线经过光栅后，通过光栅上面分布的一系列狭缝的分光，就可以获得任意波长的光，波长连续可调，一般递增量为1nm, 同时具有带宽可选的功能。
光栅式酶标仪使用方便灵活，可以通过软件选择任意波长的光，而且可以进行全波长的扫描，通过全波长扫描可以获得未知样品的吸收峰，从而可以达到检测未知样品的目的，在实验室中很受欢迎，可以进行更多实验的检测。
因此目前在国内的普及程度很高。
另外根据通道的个数，可以将酶标仪分为单通道和多通道两种类型，单通道又有自动和手动两种之分。
