本人实验新人一枚,现在做的是PCR后内切来验证基因多态性,最近遇到了一个难以解决的问题。
本人现在现在用的是天跟的PCRMIX,然后用的是omega的纯化试剂,现在遇到的问题是:我纯化后的PCR产物(只有244bp),在酶标仪、分光光度计检测下浓度相差不大,都是50ul的PCR体系中可以提取出体积35ul,浓度约50-60ng/UL的,纯度1.8-2.0之间纯化液,但是电泳看不到除了Marker之外的条带(图一),即使我加DNA总量达到了几百ng,仍然是什么都看不见,但是似乎隐约有点条带,联系OMEGA的技术后考虑其实并没有回收那么多的DNA,建议我加用异丙醇,但是我加了几百ng都看不见,我觉得加用异丙醇意义不是特别大,而且我是要做内切酶的,对DNA是有要求的(1ug),如果他们的试剂真的存在干扰浓度测定的话,接下来内切我也不好做,所以来求助一下各位大神,是否实验还有所改进,还是更换一些能更好提取小分子DNA的试剂。
PS:我做了引物浓度(华大基因)、模板DNA浓度、Tm的梯度,发现我的模板DNA需要加到几百ng,引物浓度需要加到1.6uM,才能得到比较清晰的条带,但是引物二聚体(40bp)在琼脂糖上一直很明显(图二,目的条带看起来不明显的原因是手机没拍好),PCR的纯化产物也应该是目的条带,因为我在不同引物浓度下的PCR,引物二聚体的条带亮度差别较大,但是纯化产物在酶标仪、分光光度计检测下浓度相差不大,所以应该是产物浓度。现在也是一筹莫展,**各位大神指点。
我之前好像也在丁香园看到过说是部分试剂存在这种情况,不知道各位大神有何指点。
图一(右侧为marker,最亮为200bp,我加了五个孔的样品)
图二(上面的为引物二聚体)
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