【求助】放射受体分析和液闪仪使用问题

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【求助】放射受体分析和液闪仪使用问题

2008-04-16

问题描述：

我现在正在做放射受体分析实验：提取大鼠脑膜蛋白后，用3H标记的放射性配体与之结合，测定放射性计数，做出受体饱和曲线，求KD和BMAX来测量受体功能。

有几个问题想问问大家：

1.我看到相当多文献中，结束反应用的是抽滤，由于条件的限制，我们这里没有该装置，所以就取了少数文献中的方法，用12000G离心10min结束反应，然后沉淀TRIS-HCL洗涤3次。测量时在沉淀所在的EP管中加入闪烁液（该闪烁液的配方适用于样品含水量较少的情况），每管1ML。请问大家，这样结束反应行吗？沉淀是否应该烘干？

2.我用的液闪仪计数不是很稳定，如果进行校正，尤其是读数比较小的时候（如只有数百），以减少误差？

3.加入闪烁液后，是否应该避光放置一段时间后再测量？

谢谢！

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unistar

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这样做不是很好 1 binding assay做起来不那么容易，实验中最关键的是放射性配体的浓度和蛋白浓度的比例，他决定了你所得到的数据有无剂量依赖性，需要你做预实验，每次每个剂量要做三副管，之后取均值。2 30度反应一个小时后，最好还是负压抽滤，之后烘干滤纸，放闪烁液，再计数。3 你用离心的方法，我没有做过，但给我感觉误差要大，可重复性不是很高。但可以做几次预实验看看。4 加入闪烁液后可以直接计数，如果数据不稳定，可以放置一段时间再测，我试过，一般数据差距不会很大。 5 我做的是转染后的细胞提取蛋白，蛋白浓度20ug/反应体系，反应体系100ul，同位素10000dpm（相当于1nM)实验中要注意的事项，如果测得的数值偏高，而且没有梯度，通常都是蛋白浓度过高，同位素的浓度不够。

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