【讨论】胰腺组织石蜡切片免疫荧光
2012-08-30
问题描述：
两着都是免疫荧光，santa的一抗和二抗
红色的是胰岛素，绿色的是胰高血糖素。都是石蜡切片~
请问下我这染出来的应该是胰岛细胞吧，背景颜色适合吗？
为什么胰高血糖素然不出来，这两种我用的方法是一样的。
方法：
1.脱蜡，水化：脱蜡前应将组织芯片在60摄氏恒温箱中烘烤1h
A：组织芯片置于二甲苯中浸泡15min，更换二甲苯后再浸泡10min（脱蜡）
B：无水乙醇中浸泡5min（水化）
C：95%乙醇中浸泡5min
D：75%乙醇中浸泡5min
2.PBS洗2次各5min
3.PBS洗2次每次5min，洗去枸橼酸钠（Ⅲ，Ⅱ）
4.3%H2O2(80%甲醇稀释)室温静置10min（去除内源性酶）
5.PBS洗2次各5min（Ⅰ、Ⅱ）
6.加入1%BSA稀释（0.01MPBS稀释）封闭液，37度恒温烘箱1h，顷去多余液体，不洗
7.滴加一抗用1%BSA稀释(1:50）或（1:100），先室温放置1h，然后4度过夜（放入湿盒）并用PBS代替一抗做阴性对照
8.PBS洗3次每次5min
9.滴加二抗（1:100）或（1:200），用1%BSA稀释37度恒温箱（放入湿盒）1h，避光
10.PBS洗3次各2min，避光，用摇床洗涤
11.加入20ul样品Hoechst液体（10ug/ml）5min用摇床避光
12.PBS洗3次各2min，避光，用摇床洗涤
13.滴加抗荧光猝灭剂，封片，镜检，绿色荧光
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天宝物华
用户
展开引用gaoying115 我上次的图，小鼠胰腺，鼠源insulin一抗。楼上您好，我初做这方面的实验。您是该领域的高手，能麻烦参考您的protocol一看吗？您做的是石蜡还是冰冻切片？都说用冰冻好，我感觉反而石蜡组织结构要好些。我做小鼠胰腺，考虑鼠源的一抗可能与组织有交叉反应，换了个羊源insulin一抗，也是santa的，结果背景好了些，没有周围胞膜网格样染色了，但胰岛染色很弱，santa一抗1:200稀释的，因组化是这个浓度，荧光的话，抗体浓度是不是要加大？我准备1:50或1:100试试。二抗invitrogen的1:1000稀释是否合适，我周围的人都用这个浓度。还有PBS洗的问题，我用浸在染缸洗的方式脱片严重，后改为滴在上面洗，不知是否合适？恳请大侠指教，说是简单的实验，可我做了几次都不理想，实在不知怎么办了。因后面要双标，胰岛素染不好，后面怎么染？望大侠能分享下您的protocol还有经验心得，在此跪谢！...... 这个片子首先看起来清晰度不够高，焦距是否没有调好，可以调整放大看一下，其次背景有点高，非特异性染色较强上面发的图是石蜡切片的三标染色，个人没有感觉冰切优于石蜡切片，做的好石蜡图像会更漂亮santa的goat来源insulin抗体 sc-7839 效果很不错，对于荧光染色1:500足矣，抗体浓度过高易导致高背景二抗invitrogen or jackson 都是1:1000稀释即可关于脱片问题，首先载玻片要防脱，石蜡切片实验前要适当烤片，洗片首选浸洗这个实验要注意几点：组织防脱、抗原修复、充分封闭、抗体孵育合理、洗片充分。protocol见附件Immunohistochemistry.docx(13.32k)
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天宝物华
用户展开引用gaoying115非常感谢qq69305632战友的回复！1.可能我做的冰冻切片不好吧，换了个石蜡切片，背景就没有周围胞膜网格样染色了，我是4%多聚甲醛固定了40min，后蔗糖脱水过夜，OCT包埋，速冻后切片的，应该与我切片有关吧。我们那荧光显微镜高倍不清晰，就没拍40倍的。2.我一抗二抗孵育后都洗了5min*5次，不知是否洗的时间长了而导致脱片？3.另外，我看到了您的protocol，封闭、洗涤等都是用的TBST，我用的是PBS，请问，这个有影响吗？T是tween吗，浓度是0.5%吗？4.还有石蜡切片抗原修复很关键，时间有要求吗？我们那都是加枸橼酸修复液，沸腾后1min30s，这时间可以吗？问题有些多，再次感谢您的热心帮助！......1、组织固定时间与你的胰腺大小有关，不能一概而论，全胰腺固定的话40min有点少，可以延长到2-3hrs充分固定，染色有差异应该与你的制片有一定的关系2、你的洗片时间不算长，没有剧烈的晃动话，组织脱片还是和你防脱没有做好有关3、这个会有一定影响，TBST是TBS-0.1%tween，tween-20是一种去垢剂，可以去除背景杂质，PBS-0.1%tween亦可4、抗原修复很关键！针对insulin抗原修复，我的经验是枸橼酸钠微波加热到90-95℃，不要让其沸腾！放入切片保持该温度5-10min取出冷却即可进行后续实验
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伤心定义
用户还有请教下如何可以染成这种图片，这是免疫荧光双标法吗？如何操作，下面是百度的~过程和一般的免疫染色一样就是封闭的时候用两种血清混合封闭1：1加入一抗和二抗的时候也是混合加入但是因为稀释浓度不好掌握最好提前作预试~补充一点，荧光双标记必须选择的一抗抗性不同，如一个是兔多抗，一个是鼠单抗，那么二抗分别采用抗兔，抗鼠的不同颜色标记的荧光二抗即可。
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爱y爱y
用户刚刚传的照片没显示，现在在发一遍这个是红光标记的胰岛素这个是绿光标记的胰高血糖素这个DAPI染的核这个是合成的照片很漂亮吧··
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爱y爱y
用户这样的二抗选择应该是可以做出来的，但是绿光的荧光二抗一般都是很浅的，这个绿光的稀释比是1:50做的，Jackson是国外抗体，网址我发你啊http://www.jacksonimmuno.com/pdf/specs.asp组化做不出是不是抗体不行呀，现在santa的抗体都水了，我们实验室现在都用EPI的抗体效价高呀，现在二抗好点的公司就是jackson和KPL了吧··组化也要用双氧水处理，切片放入3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。
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伤心定义
用户我怎么做成这样啊，1:50，孵育二抗一个半小时[img]file:///C:/Documents%20and%20Settings/AdmiNISTrator/Application%20Data/Tencent/Users/452425168/QQ/WinTemp/RichOle/1QA`L1O34M@R8PQS94SKJ$I.jpg[/img]
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天宝物华
用户帖子已被删除上传图片看一看胰岛的染色相比较还是比较简单的以下是本实验室的胰岛染色结果
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gaoying115
用户我上次的图，小鼠胰腺，鼠源insulin一抗。楼上您好，我初做这方面的实验。您是该领域的高手，能麻烦参考您的protocol一看吗？您做的是石蜡还是冰冻切片？都说用冰冻好，我感觉反而石蜡组织结构要好些。我做小鼠胰腺，考虑鼠源的一抗可能与组织有交叉反应，换了个羊源insulin一抗，也是santa的，结果背景好了些，没有周围胞膜网格样染色了，但胰岛染色很弱，santa一抗1:200稀释的，因组化是这个浓度，荧光的话，抗体浓度是不是要加大？我准备1:50或1:100试试。二抗Invitrogen的1:1000稀释是否合适，我周围的人都用这个浓度。还有PBS洗的问题，我用浸在染缸洗的方式脱片严重，后改为滴在上面洗，不知是否合适？恳请大侠指教，说是简单的实验，可我做了几次都不理想，实在不知怎么办了。因后面要双标，胰岛素染不好，后面怎么染？望大侠能分享下您的protocol还有经验心得，在此跪谢！
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天宝物华
用户展开引用gaoying115我上次的图，小鼠胰腺，鼠源insulin一抗。楼上您好，我初做这方面的实验。您是该领域的高手，能麻烦参考您的protocol一看吗？您做的是石蜡还是冰冻切片？都说用冰冻好，我感觉反而石蜡组织结构要好些。我做小鼠胰腺，考虑鼠源的一抗可能与组织有交叉反应，换了个羊源insulin一抗，也是santa的，结果背景好了些，没有周围胞膜网格样染色了，但胰岛染色很弱，santa一抗1:200稀释的，因组化是这个浓度，荧光的话，抗体浓度是不是要加大？我准备1:50或1:100试试。二抗Invitrogen的1:1000稀释是否合适，我周围的人都用这个浓度。还有PBS洗的问题，我用浸在染缸洗的方式脱片严重，后改为滴在上面洗，不知是否合适？恳请大侠指教，说是简单的实验，可我做了几次都不理想，实在不知怎么办了。因后面要双标，胰岛素染不好，后面怎么染？望大侠能分享下您的protocol还有经验心得，在此跪谢！......这个片子首先看起来清晰度不够高，焦距是否没有调好，可以调整放大看一下，其次背景有点高，非特异性染色较强上面发的图是石蜡切片的三标染色，个人没有感觉冰切优于石蜡切片，做的好石蜡图像会更漂亮santa的goat来源insulin抗体sc-7839效果很不错，对于荧光染色1:500足矣，抗体浓度过高易导致高背景二抗invitrogenorJackson都是1:1000稀释即可关于脱片问题，首先载玻片要防脱，石蜡切片实验前要适当烤片，洗片首选浸洗这个实验要注意几点：组织防脱、抗原修复、充分封闭、抗体孵育合理、洗片充分。protocol见附件Immunohistochemistry.docx(13.32k)
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gaoying115
用户非常感谢qq69305632战友的回复！1.可能我做的冰冻切片不好吧，换了个石蜡切片，背景就没有周围胞膜网格样染色了，我是4%多聚甲醛固定了40min，后蔗糖脱水过夜，OCT包埋，速冻后切片的，应该与我切片有关吧。我们那荧光显微镜高倍不清晰，就没拍40倍的。2.我一抗二抗孵育后都洗了5min*5次，不知是否洗的时间长了而导致脱片？3.另外，我看到了您的protocol，封闭、洗涤等都是用的TBST，我用的是PBS，请问，这个有影响吗？T是tween吗，浓度是0.5%吗？4.还有石蜡切片抗原修复很关键，时间有要求吗？我们那都是加枸橼酸修复液，沸腾后1min30s，这时间可以吗？问题有些多，再次感谢您的热心帮助！
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天宝物华
用户展开引用gaoying115非常感谢qq69305632战友的回复！1.可能我做的冰冻切片不好吧，换了个石蜡切片，背景就没有周围胞膜网格样染色了，我是4%多聚甲醛固定了40min，后蔗糖脱水过夜，OCT包埋，速冻后切片的，应该与我切片有关吧。我们那荧光显微镜高倍不清晰，就没拍40倍的。2.我一抗二抗孵育后都洗了5min*5次，不知是否洗的时间长了而导致脱片？3.另外，我看到了您的protocol，封闭、洗涤等都是用的TBST，我用的是PBS，请问，这个有影响吗？T是tween吗，浓度是0.5%吗？4.还有石蜡切片抗原修复很关键，时间有要求吗？我们那都是加枸橼酸修复液，沸腾后1min30s，这时间可以吗？问题有些多，再次感谢您的热心帮助！......1、组织固定时间与你的胰腺大小有关，不能一概而论，全胰腺固定的话40min有点少，可以延长到2-3hrs充分固定，染色有差异应该与你的制片有一定的关系2、你的洗片时间不算长，没有剧烈的晃动话，组织脱片还是和你防脱没有做好有关3、这个会有一定影响，TBST是TBS-0.1%tween，tween-20是一种去垢剂，可以去除背景杂质，PBS-0.1%tween亦可4、抗原修复很关键！针对insulin抗原修复，我的经验是枸橼酸钠微波加热到90-95℃，不要让其沸腾！放入切片保持该温度5-10min取出冷却即可进行后续实验
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littlecat324
用户展开引用爱y爱y刚刚传的照片没显示，现在在发一遍这个是红光标记的胰岛素这个是绿光标记的胰高血糖素这个DAPI染的核这个是合成的照片很漂亮吧··......
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天宝物华
用户帖子已被删除这个不是胰岛，另外你邮件发给我的也不是胰岛，正常胰岛染色图片上面有，查资料仔细看看。
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doctorliuyj
用户学习一下
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221思思
用户展开引用qq6930563221、组织固定时间与你的胰腺大小有关，不能一概而论，全胰腺固定的话40min有点少，可以延长到2-3hrs充分固定，染色有差异应该与你的制片有一定的关系2、你的洗片时间不算长，没有剧烈的晃动话，组织脱片还是和你防脱没有做好有关3、这个会有一定影响，TBST是TBS-0.1%tween，tween-20是一种去垢剂，可以去除背景杂质，PBS-0.1%tween亦可4、抗原修复很关键！针对insulin抗原修复，我的经验是枸橼酸钠微波加热到90-95℃，不要让其沸腾！放入切片保持该温度5-10min取出冷却即可进行后续实验......你做的大鼠胰腺胰岛素、胰高血糖素免疫荧光实验，用的什么抗体？每份抗体大概能做多少片子？
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天宝物华
用户221思思你做的大鼠胰腺胰岛素、胰高血糖素免疫荧光实验，用的什么抗体？每份抗体大概能做多少片子？sigma、abcam的都有。之前买了很多，一只抗体可以用很久。
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天宝物华
用户帖子已被删除这样双标的实验目的是什么你清楚否？
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天宝物华
用户帖子已被删除必须可行，荧光染色就是基于细胞分泌蛋白来进行检测的。
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221思思
用户qq693056322必须可行，荧光染色就是基于细胞分泌蛋白来进行检测的。那如果我想检测胰岛中细胞的凋亡和增生，比如β细胞，看有些文献，做的免疫荧光双标，一抗选择的是小鼠抗胰岛素和兔抗cleavedcaspase，二抗用的是FITC-羊抗小鼠IgG和cy3-羊抗兔IgG，想问一下，为什么不能做用兔抗cleavedcaspase和cy3-羊抗兔IgG做荧光免疫单标来检测胰岛中β细胞的凋亡？？
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天宝物华
用户221思思那如果我想检测胰岛中细胞的凋亡和增生，比如β细胞，看有些文献，做的免疫荧光双标，一抗选择的是小鼠抗胰岛素和兔抗cleavedcaspase，二抗用的是FITC-羊抗小鼠IgG和cy3-羊抗兔IgG，想问一下，为什么不能做用兔抗cleavedcaspase和cy3-羊抗兔IgG做荧光免疫单标来检测胰岛中β细胞的凋亡？？原因很简单，单标结果如何说明凋亡的是beta-cell而不是其他胰岛内分泌细胞？
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苹果嘿嘿
用户展开引用qq693056322上传图片看一看胰岛的染色相比较还是比较简单的以下是本实验室的胰岛染色结果......这个紫色是合成的还是本来就是紫色？
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天宝物华
用户苹果嘿嘿这个紫色是合成的还是本来就是紫色？苹果嘿嘿这个紫色是合成的还是本来就是紫色？[/quote633远红染料的标记，非重叠变色，颜色其实是confocal的伪彩。
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苹果嘿嘿
用户qq693056322苹果嘿嘿这个紫色是合成的还是本来就是紫色？[/quote633远红染料的标记，非重叠变色，颜色其实是confocal的伪彩。学习了，3Q。
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221思思
用户帖子已被删除红色+绿色=黄色？？
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天宝物华
用户221思思红色+绿色=黄色？？双标实验需要多通道观察，叠加图的话可以这么理解。
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eagle927
用户你们的PBS缓冲液都是自己配的么
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