两着都是免疫荧光,santa的一抗和二抗
红色的是胰岛素,绿色的是胰高血糖素。都是石蜡切片~
请问下我这染出来的应该是胰岛细胞吧,背景颜色适合吗?
为什么胰高血糖素然不出来,这两种我用的方法是一样的。
方法:
1.脱蜡,水化:脱蜡前应将组织芯片在60摄氏恒温箱中烘烤1h
A:组织芯片置于二甲苯中浸泡15min,更换二甲苯后再浸泡10min(脱蜡)
B:无水乙醇中浸泡5min(水化)
C:95%乙醇中浸泡5min
D:75%乙醇中浸泡5min
2.PBS洗2次各5min
3.PBS洗2次每次5min,洗去枸橼酸钠(Ⅲ,Ⅱ)
4.3%H2O2(80%甲醇稀释)室温静置10min(去除内源性酶)
5.PBS洗2次各5min(Ⅰ、Ⅱ)
6.加入1%BSA稀释(0.01MPBS稀释)封闭液,37度恒温烘箱1h,顷去多余液体,不洗
7.滴加一抗用1%BSA稀释(1:50)或(1:100),先室温放置1h,然后4度过夜(放入湿盒)并用PBS代替一抗做阴性对照
8.PBS洗3次每次5min
9.滴加二抗(1:100)或(1:200),用1%BSA稀释37度恒温箱(放入湿盒)1h,避光
10.PBS洗3次各2min,避光,用摇床洗涤
11.加入20ul样品Hoechst液体(10ug/ml)5min用摇床避光
12.PBS洗3次各2min,避光,用摇床洗涤
13.滴加抗荧光猝灭剂,封片,镜检,绿色荧光
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