一、第一向

1.等电聚焦凝胶的准备

双向电泳通常用聚丙烯酰胺凝胶作介质，但需含有8mol/L尿素、0.5%~2%非离子或两性离子去污剂。为了增加样品的可溶性，可加0.5%CHAPS。在第一向电泳中，最重要的是用载体两性电解质建立pH梯度。如“载体两性电解质pH梯度等电聚焦”所述混合不同pH范围的载体两性电解质或使用预混合的载体两性电解质可以增加第一向电泳的分辨率。

O"Farrell的ISO-DALT系统的第一向是用管状凝胶，虽然也能得到高分辨，且上样量大，对盐的耐受量也大，但会由于电内渗效应丢失碱性蛋白。平板等电聚焦时电极只与凝胶的边缘接触，电解体积小，阴极漂移小。相对来说不易丢失蛋白。将薄层凝胶聚合在支持膜上更能得到好的结果。

含有尿素、离子去污剂和载体两性电解质的凝胶聚合方法请参阅“载体两性电解质pH梯度等电聚焦”。

2.样品准备和加样

可溶蛋白的样品，如体液，细胞和组织的萃取液能直接用于双向电泳，但应稀释到合适的浓度。固体样品，如组织，细胞或在组织培养液中的细胞，加样前应先破碎，研磨和溶解。通常使用的溶解液是O"Farrell提出的9mol/L尿素和2%(W/V）非离子去污剂（NP-40或TritonX-100)。但对有些蛋白，如组蛋白、核糖体蛋白和膜蛋白的溶解仍然是困难的，必须做适当处理。

使用管状凝胶和垂直平板凝胶时，样品被加在浓缩胶的顶上，靠近电极容易引起蛋白的变化，水平电泳可加在凝胶的合适位置。有关样品的溶解、加样方法、加样量等请参阅“载体两性电解质pH梯度等电聚焦”。

3.等电聚焦

等电聚焦的方法同“载体两性电解质pH梯度等电聚焦”。由于双向电泳用的第一向凝胶和样品中含有尿素和去污剂，聚焦时的温度应稍高于通常用的温度，如15~20℃，以防止尿素结晶。如在凝胶上覆盖一层膜，也可以防止尿素结晶，并克服大气中二氧化碳的影响。由于尿素使蛋白变性，会增加蛋白分子的直径。鉴于以上一些原因，应使用新鲜样品和凝胶，并适当降低电压和增加聚焦时间。

4.pH梯度的测定

如采用表面电极进行测量，由于尿素和温度对pH的影响，应使用校正因子，请参阅“载体两性电解质pH梯度等电聚焦”的有关章节。

另一种方法是用蛋白标准作为内标准。常用的等电点蛋白标准不能用于双向分析，因为电泳条件不同。双向电泳的标准是选择一些合适的蛋白，在有尿素时加热不同时间得到的，最终在双向凝胶上呈现以一定pH单位间隔排列的点，点的数目取决于蛋白质氨基酸的组成。

5.平衡

第二向SDS电泳前，将等电聚焦凝胶按样品泳道剪成胶条，用含有SDS，在还原条件下的pH8.8Tris缓冲液平衡。目的是使蛋白质分子与SDS和还原试剂充分相互作用，解聚蛋白质分子，并与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，以确保第二向的迁移。平衡时间是很重要的因素。柱状胶约需30~40分钟，薄层胶（0.5~1mm)约需5~10分钟，超薄胶只需1~2分钟。

二、第二向

1.SDS凝胶的准备

请参阅“SDS聚丙酰胺凝胶电泳”各种不连续SDS凝胶灌注方法。

2.二向间的转移

平衡后的等电聚焦凝胶条与SDS凝胶的良好接触是双向电泳结果的保证。管状凝胶的转移需要用琼脂糖密封，但琼脂糖中的不纯物在银染时会显现斑点。如用快速丙烯酰胺聚合的方法，聚合过程中产生的热会使蛋白变性。

垂直平板电泳时凝胶间的转移可以直接放置，但要防止胶条被拉长，否则蛋白带会歪斜而使双向电泳谱畸变。薄层水平电泳间的转移比较容易，因为凝胶聚合在支持膜上，只要将等电聚焦凝胶的胶面向下，贴于SDS凝胶上，避免气泡陷入即可。为了以后分子质量的测定，在SDS凝胶的一端应加分子质量蛋白标准。

3.SDS电泳

请参阅“SDS聚丙酰胺凝胶电泳”SDS电泳的方法。

4.检测

考马斯亮蓝染色、银染色、荧光标记、放射自显影等检测方法请参阅“常规聚丙烯酰胺凝胶电泳”和“SDS聚丙酰胺凝胶电泳”。由于双向电泳的高分辨率，分离的蛋白斑点无法用肉眼来比较和辨别，应该用凝胶扫描或摄录系统将数据进行处理。