福州市疾病预防控制中心2019年实验仪器货物类采购项目招标公告采...
| 实验材料 | 样品 试剂、试剂盒 | DNA探针非同位素甲酰胺杂交混合液甲酰胺TritonX-100SSC 仪器、耗材 | 相差显微镜盖玻片水浴锅加湿盒滤光片荧光显微镜 实验步骤 | 1a. 石蜡切片或细胞的杂交：按“石蜡切片或细胞的原位杂交实验”的基本方案步骤1~7，对载玻片进行脱蜡、水化、封闭和脱水处理。将标本晾干（或在干燥器中干燥），随后贮于加有干燥剂的载玻片盒中，置-70℃过夜。 1b. 冰冻切片的杂交：按“冰冻切片的原位杂交实验”的备择方案步骤1~7，进行切片的预处理和乙酰化处理，随后进行切片的脱水。 2. 对每一杂交实验，可用乙醇沉淀10~15ng探针，重溶于10ml去离子的甲酰胺中，加5μg（0.5μl）超声处理的鲑精DNA，在70~80℃温度下热变性探针10min。 3. 加10μl主杂交混合液于变性探针中（探针终浓度为0.1~0.5μg/μl混匀），微量离心机以高速稍加离心，然后加于载玻片上。覆加22mm2盖玻片，轻压以赶去大的气泡。放入加湿盒中，在37℃温育2~4h。 4. 杂交最后30min期间，以37℃水浴，在Coplin广口瓶中，预热50ml50%甲酰胺/2×SSC洗液和50ml2×SSC。 5. 从加湿盒中取出载玻片，剥去橡皮泥（如有使用的话）并小心移去盖玻片。在37℃50%甲酰胺/2×SSC中，清冼杂交过的玻片15min；接着以37℃2×SSC洗15min；再于室温以1×SSC洗15min。 6. 玻片在室温下，以4×SSC平衡5min。取出载玻片吸去残余缓冲液，在此过程中任何时候都不要使玻片干涸。 7. 加50μl生物素检测液，地髙辛检测液或生物素/地高辛检测液于杂交过的载玻片上。用22mm2的Parafilm膜覆盖，放在一用铝箔包裹的加湿盒中，于37℃温育45min。 8. 室温下，按顺序在裹以铝箔的Coplin广口瓶中，分别用4×SSC、0.1%TritonX-100/4×SSC和4×SSC浸洗切片。毎种溶液中浸洗10min。 9. 加50μlDAPI或碘化丙锭染色液于切片上，以一块22mm2的Parafilm膜覆盖。室温下染色5min。在盛有1×SSC的Coplin广口瓶中快速浸洗，以除去多余染液。吸去残液但不要使切片干涸。 10. 加7μl适当的防褪色固片介质于已染色的切片上，覆以盖玻片。轻轻挤压除去多余的防褪色固片介质，注意勿损伤组织切片。以指甲油密封盖玻片，放在有干燥剂的玻片盒中，贮于-20℃。 |
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发布于 ： 2021-07-24
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