| 实验方法原理 | 免疫印迹法是将电泳与免疫酶染色结合起来的一种方法。它先经电泳(SDS--PAGE)将病毒结构蛋白进行分离，通过转印将被分离的各区带原位转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulosemembrane,NC膜）上，NC膜当成包被抗原的固相载体，病毒的结构蛋白能与特异性的第一抗体发生反应，借助酶标记第二抗体及底物，在相应部位显现出来，以证明病毒结构蛋白的存在。所以操作分为电泳、转印和酶免疫测定三个阶段。 | ||||||||||
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| 实验材料 | 流行性出血热病毒 试剂、试剂盒 | 丙烯酰胺单体、双体过硫酸铵TEMED蛋白Marker10%甘油考马斯亮蓝流行性出血热病毒抗血清或恢复期病人血清或特异性单克隆抗体抗兔或抗人IgG辣根过氧化物酶结合物33'-二氨基联苯胺及H202原液 仪器、耗材 | 电泳仪垂直电泳槽高速离心机电转移仪硝酸纤维素膜脱色摇床 实验步骤 | 1)样品制备：病毒感染VeroE6细胞后的上清培养液，经4℃5000r/min离心30min,离心后的上清移至超速离心管（每管35ml左右），加300g/L蔗糖-TNE垫层，25000r/min离心2h,弃上清，用少量TNE悬起沉淀即为初步纯化病毒。 2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):采用不连续系统，将25µl样品加等量样品缓冲液混合，煮沸2min待冷却后上样。电泳条件为稳流10-20mA,9-12h或50V恒压电泳过夜(14-16h)。电泳结束后取下凝胶。 部分凝胶进行常规考马斯亮蓝染色：浸入1g/L考马斯亮蓝溶液（水：甲醇：冰醋酸=5:5:1)中1h,取出凝胶用脱色液(5%甲醇，10%冰醋酸水溶液）脱色，换液数次后，用无考马斯亮蓝的5%甲醇、10%冰醋酸水溶液在脱色摇床上继续脱色至透明，照相记录。 3)蛋白条带的电转移：上述剩余的大部分凝胶置于NC膜上，电转移时在双层夹板中的层次顺序为：正极夹板海绵滤纸NC膜凝胶滤纸海绵夹板负极。电流方向从负极至正极，条件为电流0.5-0.7A,电压100~120V,时间4~6h。 4)免疫酶染色：转移完毕后，将NC膜浸入封闭缓冲液，在脱色摇床上摇动2~6h,于封闭液中直接加人特异性抗血清或恢复期病人血清（或特异性单克隆抗体），置37℃2h,用2g/LTween20PBS洗涤液洗4次，加相应的辣根过氧化物酶标记抗体(IgG),置37℃lh,同样洗涤4次，加酶染底物溶液显色数分钟，用自来水冲洗，终止反应。 (5)结果：经初步纯化的病毒标本，经上述电泳，考马斯亮蓝直接染色后或经转移，抗体及酶染色反应后，在相应部位可见三个明显流行性出血热病毒结构蛋白条带，从上到下分别代表病毒结构蛋白G1(72~68kD)、G2(55~52kD)糖蛋白和NP核蛋白(50~48kD),以NP显色最为明显。 注意事项 | 展开 其他 | 免疫印迹法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，方法简便、标本可长期保存、结果便于比较。 其他试剂： l)TNE缓冲液：50mmol/LTris-HCl,pH7.4-7.60.15mol/LNaCl,5mmol/LEDTA。 2)分离胶：2mol/LpH8.9Tris-HCl10ml,(单）丙烯酰胺/（双）丙烯酰胺(50:0.8/100ml)12.5ml,100g/LSDS0.5ml,10mol/L尿素12.5ml,TEMED50µl,过硫酸铵(30mg/ml)1.1ml,双蒸水13.4ml,总量约50ml。 3)浓缩胶：0.5mol/LpH6.7Tris-HCl1ml,(单）丙烯酰胺/（双）丙烯酰胺(50:1.5/100ml)1ml,100g/LSDS0.1ml,10mol/L尿素5ml,TEMED10µ1,过硫酸按(30mg/ml)0.3ml,双蒸水2.7ml,总量约10ml。 4)电泳缓冲液：Tris12g,甘氨酸57.6g,100g/LSDS20ml,加蒸馏水到2,000ml。 5)样品缓冲液：0.05mol/LTris-HCl(pH6.7),20g/LSDS,5%2-琉基乙醇，10%甘油，0.2g/L溴酚蓝。 6)转移缓冲液：Tris7.88g,甘氨酸28.8g,甲醇400ml,加蒸馏水到2000ml。 7)封闭缓冲液：0.02mol/LpH7.4PBS,2g/LTween20,20g/L牛血清蛋白。 8)酶染稀释缓冲液：0.02mol/LpH7.4PBS,0.5-1.0g/LTween20,10%牛血清。 9)洗涤液：0.02mol/LpH7.4PBS,2g/LTween20。 10)酶染底物溶液：3,3"-二氨基联苯胺（盐酸盐）(DAB)5mg,0.02mol/LpH7.4PBS10ml,H2O2原液50μl |
