RIPA提蛋白后总有透明粘稠的胶冻样物质，求解决办法
2021-07-20
问题描述：
RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。
操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。
这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？
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上海欧易
用户
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寒一奕
用户展开引用xiaoer25claire萱RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？楼上的问题我们在提取过程中也遇到过，解决方案有两个：一、增加裂解液RIPA的量，用枪头吸打混匀。一般出现胶状的话，枪头吸打混匀时就会发现是否有胶状。来增加或减少RIPA的量。（我们实验发现如出现胶状，蛋白浓度反而低）二、采用超声破碎一下。一般都能解决这个问题，我们采用方法一为多。友情提示下，PMSF最好是在用使用之前用加入，PMSF容易水解，大概遇水30min就会失效，所以最好不要提前很长时间加入PMSF.......请问一下如果PMSF容易水解的话，那么为什么加入PMSF的LysisBuffer放置-20度冰箱数周后，拿出来溶解还是可以闻到PMSF的味道呢？前提是LysisBuffer已经用过几次，反复冻融，还是可以闻到PMSF的味道
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上海欧易
用户欧易生物发布全自动定量Western检测服务，告别繁琐的实验步骤，从此Western检测只需3小时即可得到25个样本的定量分析数据，全程仪器自动化操作！更多详情请点击：http://www.oebiotech.com/Projects/western_blot.html
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dong3504269
用户用胰酶消化试试，细胞划得话容易出这个问题
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合肥周三
用户展开引用claire萱RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？......多煮一会
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claire樱奈
用户展开引用合肥周三claire萱RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？多煮一会......我们是先测浓度然后再煮蛋白，您是指先煮蛋白然后测浓度么？那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢？
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合肥周三
用户展开引用claire萱合肥周三claire萱RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？多煮一会我们是先测浓度然后再煮蛋白，您是指先煮蛋白然后测浓度么？那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢？......煮过不测，
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诸葛小汐
用户可以使用那种小注射器带针头的，反复抽打样品
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shylook
用户去垢剂加少了
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claire樱奈
用户展开引用合肥周三claire萱合肥周三claire萱RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？多煮一会我们是先测浓度然后再煮蛋白，您是指先煮蛋白然后测浓度么？那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢？煮过不测，......煮过不测浓度怎么保证上样量一致呢？求解答
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山依凉月
用户shylook去垢剂加少了去垢剂是什么
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qinjiehm
用户展开引用山依凉月shylook去垢剂加少了去垢剂是什么......SDS
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合肥周三
用户展开引用claire萱合肥周三claire萱合肥周三claire萱RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？多煮一会我们是先测浓度然后再煮蛋白，您是指先煮蛋白然后测浓度么？那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢？煮过不测，煮过不测浓度怎么保证上样量一致呢？求解答......内参灰度调整
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skyhorse1984
用户胶冻样的东西是DNARIPA的裂解力度很强推荐六孔板每孔加200微升这样降低DNA的浓度再去煮应该出胶东的可能性就小如果还不行建议改裂解液配方为triton-100或NP-40
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晴耕雨读青山绿水
用户展开引用claire萱合肥周三claire萱合肥周三claire萱RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？多煮一会我们是先测浓度然后再煮蛋白，您是指先煮蛋白然后测浓度么？那煮过得蛋白用什么方法测浓度呢？煮过不测，煮过不测浓度怎么保证上样量一致呢？求解答......调整内参
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天命之殇
用户我一般都把这坨东西直接吸走，小心点挑出来就好了
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xiaoer25
用户展开引用claire萱RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？......楼上的问题我们在提取过程中也遇到过，解决方案有两个：一、增加裂解液RIPA的量，用枪头吸打混匀。一般出现胶状的话，枪头吸打混匀时就会发现是否有胶状。来增加或减少RIPA的量。（我们实验发现如出现胶状，蛋白浓度反而低）二、采用超声破碎一下。一般都能解决这个问题，我们采用方法一为多。友情提示下，PMSF最好是在用使用之前用加入，PMSF容易水解，大概遇水30min就会失效，所以最好不要提前很长时间加入PMSF.
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xiaoer25
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寒一奕
用户展开引用xiaoer25claire萱RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？楼上的问题我们在提取过程中也遇到过，解决方案有两个：一、增加裂解液RIPA的量，用枪头吸打混匀。一般出现胶状的话，枪头吸打混匀时就会发现是否有胶状。来增加或减少RIPA的量。（我们实验发现如出现胶状，蛋白浓度反而低）二、采用超声破碎一下。一般都能解决这个问题，我们采用方法一为多。友情提示下，PMSF最好是在用使用之前用加入，PMSF容易水解，大概遇水30min就会失效，所以最好不要提前很长时间加入PMSF.......请问一下如果PMSF容易水解的话，那么为什么加入PMSF的LysisBuffer放置-20度冰箱数周后，拿出来溶解还是可以闻到PMSF的味道呢？前提是LysisBuffer已经用过几次，反复冻融，还是可以闻到PMSF的味道
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yghjk
用户样品太浓，DNA释放出来了http://dwz.cn/3Ni78j使用ImageJ进行条带灰度扫描
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zgpat
用户展开引用claire萱RAW细胞，6孔板，RIPA提取蛋白（提前加好PMAF），每孔100uLRIPA，冰上用tip倒过来刮细胞，放置15min，12000gX15min离心，取上清。做WB时，沸水煮5min,胶冻样物质还是存在。操作过程中发现离心后还是有胶冻样物质，和上清混在一起无法分开，严重的时候基本上全是胶冻样物质。这个胶冻样物质应该是DNA，园友提供的方法为用超声碎裂器，但是我们实验室没有。请问还有别的方法可以使用么？......体积小超声会有液体飞溅造成损失，每个样品都加点DNase消化一会就行了
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rabbies
用户我的也这样求解。
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JacquelineLiu
用户请问可以把使用超声碎裂器提取细胞的方法发给我看一下吗？非常感谢！另外，看看这个有没有帮助？http://wenku.baidu.com/link?url=SgeFb3fszuHss8uqw2hvenhShYED7uGh6B5pGKwnqM1YvJpqOY2JqbSGG6qwcIzqssA3WjHxNqwDPzuNtHK1S5CgVJmNeEeRkcbHZDqvm3W
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zyz突破局限
用户6孔板才加100ul裂解液，少了一点，应该加到500-1000ul，用RIPA裂解细胞样品总会出现胶冻样物质，增加裂解液和反复吹打多几次，RAW细胞本来就不太好裂解，需要增加裂解时间到15-20分钟
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zyz突破局限
用户zyz突破局限6孔板才加100ul裂解液，少了一点，应该加到500-1000ul，用RIPA裂解细胞样品总会出现胶冻样物质，增加裂解液和反复吹打多几次，RAW细胞本来就不太好裂解，需要增加裂解时间到15-20分钟而且在6孔板中裂解，裂解20分钟左右后再用tips刮下裂解产物，拿去4度离心，小心吸取上清就行了
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claire樱奈
用户展开引用JacquelineLiu请问可以把使用超声碎裂器提取细胞的方法发给我看一下吗？非常感谢！另外，看看这个有没有帮助？http://wenku.baidu.com/link?url=SgeFb3fszuHss8uqw2hvenhShYED7uGh6B5pGKwnqM1YvJpqOY2JqbSGG6qwcIzqssA3WjHxNqwDPzuNtHK1S5CgVJmNeEeRkcbHZDqvm3W......非常不好意思呀，我们实验室没有超市碎裂器，所以我也不知道具体的方法呢，建议你@其他大神试试哈
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