荧光原位杂交技术的原理

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荧光原位杂交技术的原理

2021-08-06

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寺田伊织

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荧光原位杂交技术的原理荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。利用荧光染料与被研究对象（蛋白、多肽等）吸附或共价结合后其荧光特性发生改变，从而反映有关研究对象性能的信息。荧光标记染色体的基本原理是通过标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，获得细胞内多条染色体（或染色体片段）或多种基因状态的信息。用已知的荧光素标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。向左转|向右转

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荧光原位杂交技术问世于70年代后期，其曾多用于染色体异常的研究，近年来随着FISH所应用的探针钟类的不断增多，特别是全Cosmid探针及染色体原位抑制杂交技术的出现，使FISH技术不仅在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤学研究，如基因诊断基因定位等。原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次检验均需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误差等。与之比FISH则具有：①操作操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年；②方法敏感，能迅速得到结果；③在同一标本上，可同时检测几种不同探针；④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究，而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究等特点。荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体也可以是间期细胞．间期细胞可以是冰冻切片，也可以是细胞滴片或印片。生物素（Biotin），地高辛（digoxigenin），dinitrophenyl（DNP），aminoacetylfluorine（AAF）等均可用于探针标记。前两者较为常用，通常采用切口平移法（Nicktranslation）或随机引物法（RandomPrimer）对探针标记。在已知探针DNA结构及序列情况下也可采用PCR或RNA逆转录法标探针。通常用于Biotin标记的探针应大于1000bp以下的探针，不易标记成功。对PCR技术来标记。近年来，Vysis公司成功的生产些大片段的DNA探针（100-400kb）。由于控针较长故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化，而且杂交信号更强。如探针是具有重复序列的DNA或粘粒、YAC探针，在杂交液中加上用超声断碎的人体胎盘组织DNA或CotDNA,以阴断探针和染色质之间非特异性的结合。荧光信号在高压汞灯产生的短波激发光下常引起荧光信号淬灭的发生，可将DAPI或PI稀释于P-phenlenediomine的甘油缓冲液中。任何荧光显微镜均可用于观察FISH信号，但对单拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。如采用双色或多色滤光片可以同时观察FITC、Texas-Red等多种颜色的FISH信号，不论是染色体还是单拷贝基因的FISH信号均可用高度敏感和高分辨率的彩色胶片摄取，也可通过CCD（chargecoupleddevice）的照相系统或LaserScanningConfocalImagingSystem（激光扫描共焦成像系统）将摄取的信号储存在计算机内，经软件处理后，将信事情显示在荧光屏上。由于有多种方法标记DNA探针，故一次杂交可以同时观察多个探针的信号，如两个不同的探针分别用Biotin和Digoxigenin标记，杂交后用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分别与探针上的Biotin和Digoxigenin结合，应用双色滤光片，在显微镜下就可以同时看见带有绿色荧光的FITC和红色荧光的Texas-Red信号。同理，采用三种或三种以上不同的半抗原，如Biotin,DIG和DNP等标记探针，然后用多种不同颜色的荧光素，如FITC（绿色），Rhodamine（红色），AMA或CascadeBlue（蓝色）等结合抗体进行检测，可同时得到多种不同颜色的荧光信号，如采用不同的排列组合，最多可同时检测7种不同的探针。由于常规的荧光显微镜的照像系统，彩色胶片不易多次曝光，限制了这种联合标探针的应用，使用DigitalImagingCameraSystem或CCD照像系统，先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统事例各次得到的影像，最终形成一个复合的多颜色的图像。此外，对已做过G显带的染色体片子用75%酒精或甲醇褪色后，可再做FISH这样可更清晰的辨认各条染体及染色色体结构异常（包括某些复杂的易位，插入，倒位等）FISH和G显带技术结合不仅可以用新近G带处理过的片子，而且还可用陈旧的G带片子。因此，FISH技术可成功的帮助细胞遗传学家做出回顾性分析。FISH技术和RFLP（RestrictFragmentLenthPolymorphysim）结合，可以更精确地描述原必于染色体长短臂等结构改变和染色体梳型或复制片段的性质。FISH和细胞免疫化这技术结合，可以同时用多种颜色反应检测不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点，转录和翻译和产物，有助于对核甙酸结构与功能以及基因表达产物之间关系的研究。在基因图谱绘制中，FISH和Linkagemapping结合起来，即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地定下来。向左转|向右转

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