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- Assay Principle
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Key Benefits
- Highly effective and stable chemiluminescent assay for SEAP.
- Extremely sensitive, detect alkaline phosphatase at attogram level.
- Simple and fast assay-add the reagent directly to your experimental samples. Plate can be incubated and read in 5 min.
- Works for cell culture media and tissue lysates.
Additional information
| Kit Size | 100 |
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Secreted alkaline phosphatase (SEAP) is widely used as a reporter to study gene expression. SEAP is secreted into the culture supernatant of the transfected cell lines. SEAP activity in the culture medium reflects changes in intracellular concentrations of SEAP mRNA and protein. The changes of gene expression can be easily assayed using the same cultures by repeated sampling. Cell Technology’s aCellaTM – SEAP detection kit utilizes a Chemiluminescent-based assay technique to detect SEAP reporter gene expression. It provides an extremely sensitive tool to quantitate SEAP and analyze transcriptional and promoter activity in transfected cells.
In the assay, a chemiluminescent substrate was used to detect the Secreted Alkaline Phosphatase in cell culture. The stabilized 1, 2-dioxetane substrate provide high signal to noise ratio, wide dynamic range, rapid results and excellent reproducibility. The SEAP enzyme transfers the phosphoryl residue via a phosphoryl-enzyme intermediate. The intermediate is not stable and decomposed and emits light for detection. The assay can detect alkaline phosphatase at attogram level. The kit provides sample material for 100 assays in a 96-well plate format.
Figure 1. Standard curve of Alkaline Phosphatase (AP). 50 µl serial dilutions of AP (Starting dose 100 mU in tubes) were added to the wells of 96-well luminescent plate. 50 µl of Chemiluminescent substrate was added and the plate was read immediately with a luminometer.
Figure 2. Detection of the functional activity of NF-ĸB/SEAP stable reporter cell line. NF-ĸB/SEAP reporter cells (IML-101) were plated in 96-well plates at 50,000 cells/well. After 24 hours of incubation, cells were stimulated with different doses of TNFα for another 24 hours. 50 µl culture supernatant was added to the wells of 96-well white opaque luminescent plate. 50 µl of chemiluminescent substrate was added and the plate was read immediately with a luminometer.
Figure 3. Inhibition of TNFα activity by a quinazoline TNFα inhibitor (EMD Millipore Cat# 545380-34-5) with NF-ĸB/SEAP stable reporter cell line. NF-ĸB/SEAP reporter cells (IML-101) were plated in 96-well plates at 50,000 cells/well. After 24 hours, 10 ng/ml of TNFα and different dose of TNFα inhibitors were added into each wells. Cells were incubated at 37°C for 24 hours. 50 µl culture supernatant was added to the wells of 96-well white opaque luminescent plate. Then 50 µl of Chemiluminescent substrate was added and the plate was read immediately with a luminometer.
| Document Title |
| aCellaSEAPProtocol |
ebiomall.com
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1. 免疫荧光细胞化学技术把已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量。2. 免疫酶细胞化学技术是目前免疫组织化学研究中最常用的技术．基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究。3.免疫胶体金技术就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究．由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究。
做荧光抗体试验时，定量测定荧光素的含量用到的是哪个波长？
这些常用免疫组织化学方法的原理如下：
1. 免疫荧光细胞化学技术
将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.
2. 免疫酶细胞化学技术
是目前免疫组织化学研究中最常用的技术．基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究．
3. 免疫胶体金技术
就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究．由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究．向左转|向右转
CD133抗原为5次跨膜( 5_transmembrane, 5_TM )糖蛋白。
CD133抗原可被3种CD133抗体识别：克隆AC133、293C3和AC141。AC133直接与CD133/1糖基化抗原表位结合，可用于从外周血、骨髓、脐带血及其它组织中分析和分选CD133+细胞。
多数情况下CD133/1和CD133/2识别同种细胞，只是有表达强度的差别，但是在骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和某些急性髓性白血病中发现CD133/1和CD133/2表达不同，或者正常表达强度紊乱。
2．放射免疫检测放射免疫检测技术是目前灵敏度最高的检测技术,利用放射性同素标记抗原（或抗体）,与相应抗体（或抗原）结合后,通过测定抗原抗体结合物的放射性检测结果.放射性同位素具有pg级的灵敏度,且利用反复曝光的方法可对痕量物质进行定量检测.但放射性同位素对人体的损伤也限制了该方法的使用.
3．酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法.该方法是将二抗标记上酶,抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来,根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结果,其敏感度可达ng水平.常见用于标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶（AP）等.由于酶联免疫法无需特殊的仪器,检测简单,因此被广泛应用于疾病检测.常用的方法有间接法、夹心法以及BAS－ELISA.间接法是先将待测的蛋白抱被在孔板内,然后依次加入一抗、标记了酶的二抗和底物显色,通过仪器（例如酶标仪）定量检测抗原.这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差.目前已逐渐被夹心法取代.夹心法利用二种一抗对目标抗原进行捕获和固定,在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性.近年来,抗原的定量检测技术也不断推陈出新.近年来,在夹心法ELISA的基础上,开发了多抗原检测试剂盒,能同时检测微量液相样本中多个抗原含量.这项技术的应用大大缩短了诊断的时间,提高诊断的可靠性和及时性.
4．免疫金胶体技术胶体金技术经过30多年的发展到现在已日趋成熟,该方法是将二抗标记上胶体金颗粒,利用抗原抗体间的特异性反应,最终将胶体金标记的二抗吸附于渗滤膜上,此方法简单,快速,广泛应用于临床筛查.
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荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水。在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。在多种应用（如荧光抗体技术）中被广泛用作为荧光示踪物。桔黄色或淡黄红色至红色粉末，加热时成晶体，它的碱金属盐溶于水，荧光很强。用作沉淀滴定的吸附指示液。[1]
中文名
荧光素
英文名
Fluorescence
别称
荧光黄；荧光红；荧光橙；酸性黄73[2]
化学式
C20H12O5
分子量
334.31[1]
CAS登录号
2321-07-5
EINECS登录号
219-031-8
熔点
125-127℃[1]
水溶性
稍溶于水
外观
桔黄色或淡黄红色至红色粉末
应用
吸附指示液
安全性描述
S22-24/25-37/39-26-36/37/39-27[3]
危险性符号
Xi[3]
危险性描述
R43-36-36/37/38[3]
目录
1 基本信息
2 理化特性
3 毒理学数据
▪ 急性毒性
▪ 致突变性
4 编号系统
5 性状描述
6 用途说明
7 合成方法
8 贮藏方法
基本信息
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中文名：荧光素
英文名：Fluorescein
中文别名：荧光素；荧光红；荧光黄；荧光橙；酸性黄73；2-(6-羟基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸
英文别名：Fluorescein;2-(6-Hydroxy-3-oxo-(3H)-xanthen-9-yl)benzoic acid;Acid Yellow 73
理化特性
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外观：桔黄色或淡黄红色至红色结晶性粉末。
气味：无气味
熔点/凝固点(℃)：125-127℃(dec.)
沸点、初沸点、沸程(℃)：620.8℃/760mmHg
溶解性：溶于丙酮、吡啶、热乙醇、甲醇、甲酸、碳酸碱和氢氧化碱溶液，并显亮绿色荧光；稍溶于水、醇、醚、苯、氯仿、乙酸、二甲苯、硝基苯，不溶于石油醚。[2]
毒理学数据
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急性毒性
大鼠腹腔LDLo： 600 mg/kg
小鼠静脉LC50：300 mg/kg
小鼠LCLo：600 mg/kg
兔子静脉LDLo;300 mg/kg
豚鼠LDLo;400 mg/kg。[4]
致突变性
DNA加合物检测系统：细菌—大肠杆菌：15umol/L
编号系统
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CAS号：2321-07-5
MDL号：MFCD00005050
EINECS号：219-031-8
RTECS号：LM5075000
BRN号：94324
PubChem号：24859566[4]
性状描述
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与碳酸钠（钾）、氢氧化钠（钾）等强碱反应生成荧光素钠（钾），易溶于水，并有强烈绿色荧光，荧光量子产率0.65（pH=7水溶液）。[1]
用途说明
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1.沉淀滴定的吸附指示剂：
配成0.1%的乙醇溶液，或用其钠盐配成1%的水溶液。用Ag+滴定Cl-、Br-、I-、SCN-、CN-、C2O42-、SO42-、CO32-等，在中性或弱碱性介质中，滴定终点颜色由黄绿变为玫瑰红色。[1]
2. 荧光素是发光物质的基质。使许多生物具有荧光的物质。它与ATP形成复合物（荧光素腺苷），然后再与荧光素酶(1uciferase)结合。氧化过程中激活的荧光素发光。整个反应用作活的生物的检出或对很低程度的细菌污染作定量分析。例如用荧光光度计计量。[4]
3.用作化学分析的指示剂、生物染色剂和化妆品着色剂。
4.防冻液重要的颜料，可使防冻液呈现出绿色荧光。
合成方法
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将间苯二酚加热至150℃，使之全部熔融，边搅拌边加入理论量的邻苯二甲酸酐，混匀并熔融后升温至185℃，保温半小时，然后慢慢加入适量新焙烧的无水氯化锌，当完全溶解后，逐渐升温至210～215℃，整个过程均需不停地搅拌，当反应液开始变稠时，停止搅拌，继续在此温度下加热至完全固化，研碎后得粉状粗品。将粉状粗品与稀盐酸混合加热煮沸，以浸出氯化锌和剩余的间苯二酚，抽滤后水洗、干燥，再用乙醇提取，晾干后即得红色固体荧光素。[4]
贮藏方法
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避免氧化物接触，保持容器密封，放入紧密的储藏器内，储存在阴凉，干燥的地方。[4]
细胞生物学技术
SPSS软件统计结管归析其析都看SIGSIG=significance意显著性面值统计P值P值0.01<P<0.05,则差异显著P<0.01,则差异极显著
F值差检验量整模型整体检验看拟合程没意义
t值每自变量（logistic归）逐检验看beta值β即归系数没意义
T数值表示归参数显著性检验值绝值于等于ta/2(n-k)（值表示根据置信水平自由度数值）拒绝原假设即认其解释变量变情况解释变量X解释变量Y影响显著
F值归程显著性检验表示模型解释变量与所解释变量间线性关系总体否显著做推断若F>Fa(k-1,n-k),则拒绝原假设即认列入模型各解释变量联合起解释变量显著影响反则显著影响
