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鼠源性抗体应用于人体会产生抗鼠抗体反应(HAMA )等,妨碍其在临床上的应用,所以要制备人鼠杂交和完全人源化的抗体,减少抗体中的鼠源成分,尽量保留原有抗体的特异性.
随着基因技术的蓬勃发展，单克隆抗体以其高特异性、有效型和安全性正在成为国际药品市场上的一大类新型诊断和治疗药物，在肿瘤和其他治疗领域中成为了市场的新宠。由于抗体药物在市场上的卓越表现，在这些抗体药物专利过期后催生了一类生物药物-Biosimilar（也称为Biobetter或Follow-onBIOLOGics），此类药物是在原创生物药物产品的专利保护过期以后，生产的区别于原创生物产品的类似物。[1]这种原创生物产品的类似物称为生物仿制药，生物仿制药是一种与原研药具有相同的活性成分，在剂量、剂型、给药途径、安全性、有效性、质量、治疗作用以及适应症上没有显著差异的一种仿制品。
生物仿制药是生物制剂的仿制品，相比化学小分子的仿制药而言，生物仿制药的制造工艺难度更大，要求的生物技术也更多。从国内的注册申报的政策来看，即便是生物仿制药也需要经过三期200例临床试验，达到不低于原研药的药效时，才能批准上市，因此具有一定的仿制难度。同样，对于单克隆抗体的生物原研药厂家，通过注册申报政策和有效的专利布局，适当延长原研药品的专利保护期并不是一件困难的工作，具体应该如何进行呢，下面作者将进行逐一分析。
新药研发过程时间较长，根据美国食品药品监督管理局（FDA）统计，一种新药从研发到最后投入市场平均需要12年，其中实验室研究需要占用5年时间。[2]
通常单克隆抗体药物的研发单位都是在设计出人源化的单克隆抗体，并证明该人源化单克隆抗体具有预计的体内体外实验效果后，就将该人源化的单克隆抗体结构申请专利保护。为了使得抗体专利获得较大的保护范围，有经验的专利代理人在撰写的时候，首先是通过限定轻链CDR区的序列，再限定重链CDR区的序列，然后限定FC区的序列这样层层限定的得到一个合理的抗体的保护范围，这样不仅保护了自己的产品，只要与自己产品相同CDR区的抗体也落入了本发明的专利范围内。然而，当申请人碰到没有经验的专利代理人，这时专利申请的权利要求仅仅保护了自己产品中的抗体序列。尽管这样，只要本专利申请能够顺利得到授权，就达到了完全保护自己产品的目的。说到这里，可能与我们通常理解的专利不大一样了，一个没有排它性的专利能够保护自己吗？如果仿制药厂家在抗体的FC段稍作改动，专利不是就不侵权了吗？
虽然专利不侵权，但是如果有其他企业为了避免专利的侵权，稍微改动抗体的序列，根据《药品注册管理办法》（局令第17号）附件三：生物制品注册分类及临床申报资料要求，对于与已上市销售制品结构不完全相同且国内外均未上市销售的制品（包括氨基酸位点突变、缺失，因表达系统不同而产生、消除或者改变翻译后修饰，对产物进行化学修饰等），这类药物属于注册分类中的新药，需要按照新药进行临床试验，也就是临床Ⅰ期的20例、临床Ⅱ期的100例以及临床Ⅲ期的300例试验都要完成。此外，对于这类的生物制品也是依然要完成临床前的毒理实验、药理实验和药效学实验，这样算下来，临床前和临床阶段要做的试验数目一点也不比原研单位的实验数目少，因为临床Ⅲ期是以原研药作为对照，只有不差于原研的药效才可获批，所以面临的失败风险也很高，假设成功的话，需要的研发时间也要12年。
单克隆抗体结构的专利申请工作通常也是在临床前就已经申请了专利，距离真正的药品上市还有将近十年的时间，那么对于20年的专利保护期而言，药品上市后能够获得保护的时间只有10年甚至更短的时间了，接下来，对于新药研发单位而言，还能够申请哪些专利来有效地保护抗体新药呢？
另外，与化学药品制备方法不同的是，生物药品在制备中需要的原料是宿主细胞株，也要通过专利将宿主细胞株保护起来，而且作为与抗体结构同等重要的地位进行保护。这主要源于《药品注册管理办法》（局令第17号）附件三：生物制品注册分类及申报要求，对于与已上市销售制品制备方法不同的制品（例如不同的表达体系、宿主细胞等），即注册分类中的第10类生物制品在临床上按照新药进行临床试验，也就是说，临床Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期实验一个都不能少，临床前在药理毒理方面的试验能够比原研生物药少一点，其他的药学实验也是一样的。
在生物制品宿主细胞株的这类专利中，通常会涉及到生物抗体的表达方法，也是我们所说的药品制备方法。生物药品的制备方法通常在药品申报临床前形成。有时，由于药品进入临床，生物药品需要扩大生产，原有的制备方法有时需要重新调整，形成了新的制备方法。这时，对于专利申请来说，如果在临床前就将制备方法申请了专利，后续再申请改进工艺的专利申请时，往往会出现在先申请影响再后申请的专利创造性，导致扩大生产后的制备方法难以获得专利授权。
为了避免以上情况的发生，建议在先的制备方法通过公司机密的方式进行保护。等到在后的制备方法确定下来，将在先和在后的两种制备方法同时申请专利。由于在后制备方法的形成时间已经是药品的临床试验期了，所以通过制备方法专利还能够起到通过专利延长药品保护时间的目的。
原研生物制药单位在做这类专利申请的时候，建议把制备抗体专利申请安排在临床I期试验结束或者临床Ⅱ期试验中，大约在抗体结构专利申请之后的5-7年之间。为什么选择在这个时间点呢？根据药品研发经验，临床Ⅱ期和临床Ⅲ期通常的研发周期在五年左右，这时也正好是方法专利从提交到授权的周期。一方面刚好在临床Ⅲ期试验结束后，产品拿到新药证书，专利也正好获得授权；另一方面，如果在临床Ⅲ期实验结果非常好，原研单位对外公开产品信息的时候，重要的专利还在审查期间，那么该专利申请会面临很多的公众意见的情况，这些都会影响此类专利申请的授权。
在做生物药品宿主细胞株、制备方法这类专利申请的时候，还需要考虑未来药品的质量标准。原研单位也是以后该药品的质量标准制定者，仿制药厂家如果无法达到该标准，仿制药品也无法得到批准。因此，能够实现未来上市药品质量标准的制备方案都要在该专利中保护起来。举个例子，对于实现原研药品中“杂质含量控制在某一范围内”是该药品以后的行业标准，那么有将“该杂质含量控制在某个范围内”的药品制备方案都要在该专利申请的权利要求中保护起来。
即便有的企业为了绕开过以上药品宿主细胞株的专利，另辟其他制备方法的工艺路线，也相当于一个新药的研发周期。
此外，对于原研的生物制药单位而言，以上的宿主细胞株、制备方法专利申请在撰写时要结合向国家药监局正式申报材料中的记录来撰写，比如与申报材料相同的宿主细胞株、载体的构建方法、表达方式等都要通过该专利申请的权利要求保护起来。另外，宿主细胞株要记得去保藏。[3]
说完抗体结构专利和宿主细胞株专利申请，那么接下来说一下抗体制剂的专利了。生物药品与化学药品不同，可选择的制药辅料很少，尽管如此，有的生物药品为了克服粘度过大、稳定性差等缺陷，还是会在制药辅料上做一些研究，从而得到一个稳定性好，使用效率高的制剂。这时的制剂在申请专利时，因为有了以上这些与现有技术不同的地方，专利申请具有创造性，也能得到授权。建议这类制剂专利申请作为整个生物药品专利布局中的一部分进行申请。从产品的研发流程来看，制剂技术在临床前就已经完成了，但是为了通过制剂专利起到延长药品专利保护期的目的，建议制剂的相关专利申请在临床Ⅱ期结束或者临床Ⅲ前提交，尽量保证在产品获得新药证书前，得到专利授权。
制剂专利申请撰写时的要求类似于宿主细胞株专利申请，需要考虑未来药品的质量标准。首先向国家药监局提交正式申报材料中的抗体制剂的技术方案必须包括在该制剂的权利要求中。此外，为了扩大保护范围，申请人还可以写一些自己没有用到的，但是能够达到同样质量标准制剂的技术方案写入专利申请的权利要求中。比如说：为了实现与原研药品生物利用度的相同标准，需要的其他技术方案也要进行专利保护。可以用一篇专利申请保护，也可以用多个外围专利申请把这些技术方案保护进去。
仿制药企业为了规避专利，必然要在制剂上进行绕道，绕道形成的新制剂在《药品注册管理办法》中的分类分到了13类，按照《药品注册管理办法》，注册分类13的制品也是需进行Ⅲ期临床试验，临床试验例数不少于200例。
对于抗体的原研单位而言，因为自己的产品是第一个进入市场的，所以，相关的行业标准也都是自己制定的。如果抗体制剂的专利保护方案能够和自己制定的行业标准捆绑在一起，那么对于仿制药企业而言，冲破原研药企在整个制剂专利布局上的技术壁垒，再经过200例临床试验，需要达到不差于原研药品的临床效果难度非常大。因此，作为整个单克隆抗体药物专利布局最后的一个制剂专利，又一次地将药品的专利保护时间得以延长。
总结
单克隆抗体药物由于制备生产难度大，在《药品注册管理办法》中对于仿制药和新药在临床和临床试验前进行了严格的规定，因此，对于原研单克隆抗体制药企业，做好在抗体结构、宿主细胞株、抗体制剂三个方面的专利布局，就能够将自己的药品得到有效地专利保护，并通过专利将自己产品的专利保护期有效延长。（作者：托娅）
注释：
[1]《单克隆抗体药物与研发趋势》GE单克隆抗体手册。
[2]王友同，吴梧桐，吴文俊我国生物制药产业的过去、现在和将来药物生物技术2010,17（1）：1-14
[3]《用于专利程序的微生物保藏办法公告》中国专利局公告（第8号）
转自中国知识产权网，http://www.cnipr.com/yysw/zscqzlygl/201611/t20161125_199955.htm（原文责任编辑：ShanYuqiu）
先说骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合，共有3种情况，B淋巴和B淋巴融合，B淋巴和骨髓瘤细胞融合，骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合
第一次筛选是为了筛选出能无限增殖的细胞，这只有两种情况：
1、经过免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞
2、骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞
第二次是为了筛选出能产生单克隆抗体的细胞
那么只可能是，经过免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞。
所以有两次筛选
首先是一个抗体药物的releaselotstest：
?ProteinConcentration----------------------70.9mg/mL[63.0-77.0]
?Potency----------------------100%[80-125%]
?ID(immunoassay)----------------------Pass
?SE-HLC-----------------------MP:99.8%,HMW:0.2%,LMW:0.0%[MP≥99%]
?CE-SDS,reduced----------------------HC+LC:98.9%,HC:66.8%LC:32.1%[LC+HC≥98%]
?CEX-HPLC-----------------------MP:89.6%,Acidic:2.7%,Basic:7.7%[≥80%]
?CEX-HPLCID-----------------------Pass
?Osmolality-----------------------314mOsm/kg[300±50]
?pH----------------------5.2at24.6°C[5.0–5.4]
?Appearance-----------------------Report
?Volume-----------------------1.2mL(average1.1525mL,n=5)[≥1mL]
?Sub-visIBLeParticulate----------------------29particles/container≥10μm[nomorethan6000]
3particles/container≥25μm[nomorethan600]
?Sterility--------------------------------------Pass
?BacterialEndotoxin-----------------------<0.2EU/mL[≤5.0]
?CHOPELISA-----------------------4.4ppm
?Protein-AELISA-----------------------<0.5ppm
?DNAQPCR-----------------------<1pg/mg
以上各项指标基本是反映了对抗体药物最终产品的质量要求，用到的一些方法也比较的明了，可以作为抗体药物开发的参考。
版主zhulikou431留言:
加分鼓励有价值的话题。
1．材料
(1) 细胞：取对数生长期的细胞。
(2) 10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。
(3) 20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
(4) 灭菌的2ml安瓶等
2．操作方法
(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。
(3) 1 000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞／ml。
(3) 取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。
(4) 用器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。
(5) 放4℃ 2h。
(6) 放液氮罐气态部分（-70℃）15h。
(7) 转入液氮部分。
复苏
1．从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。
2．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。
3．逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。
4．5％CO2饱和湿度，37℃培养。
5．4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。
6．继续培养，换液，以至形成单层。
向左转|向右转
在过去的20年，单克隆抗体逐渐成为癌症治疗中的支柱。从最初应用价值有限的鼠源单抗到最近新的CAR-T技术，研究者们不停地摸索改进创新。最近一期的《NatureReviewsCancer》杂志刊登了基于单抗的癌症疗法综述。文章从四个方面介绍了单抗在癌症治疗里的用途。
癌细胞靶向疗法：恶性肿瘤细胞表面表达着一些异于普通健康细胞的抗原，这些抗原可以作为单克隆抗体的良好靶点。体外与动物体内的实验显示，针对这些靶点的抗体可以引起细胞的凋亡，并通过补体介导的细胞毒性(complement-mediatedcytotoxicity,CMC)以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)杀死靶细胞。但是在不同临床实验中，具体是哪一种机制更为重要还有待研究.
改变宿主体内应答：VEGF等血管内皮生长因子促进肿瘤内血管生长(angiogenesis)，为肿瘤提供优越的生长环境。因此通过抑制VEGF来抑制血管生成的抗体如Bevacizumab等成为有效的抗癌药物。但由于其不能直接作用于癌细胞，此类抗体药物通常与其他具有细胞毒性的药物结合使用。另一个方法是T细胞检验点阻断(Tcellcheckpointblockade)。在T细胞免疫中，配体和受体的共调控在肿瘤特异性T细胞的激活和抑制中起着重要作用。精确控制的T细胞检验点影响免疫系统的反应，避免免疫系统过度激活。抑制这些检验点的单抗被叫做检验点阻断抗体，它们可以诱导更强的肿瘤免疫反应，使反应维持更久的时间。目前常用的抗体包括阻断CTLA4的Ipilimumab和PD1的抗体pembrolizumab和nivolumab。PD1抗体在何杰金淋巴瘤的初期临床实验中显示出很好的效果.
运输具有细胞毒性的分子：近年来，“智能炸弹”(smartbomb)被用来描述这一系列向癌细胞运输细胞毒性分子的单抗。这些分子包括放射免疫偶联物，具有细胞毒性的小分子以及免疫系统里的细胞因子。放射性元素被用于标记抗体，进行肿瘤的诊断和治疗。淋巴瘤是较为适合放射性疗法的癌症，目前被FDA批准的药物有ibritumomabtiuxetan和tositumomab。抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugates)是最近研发的极具前景的抗癌药物。它将带有细胞毒性的药物和具有特异性的抗体偶联，提高了特异性同时更好地杀死肿瘤细胞。此外免疫细胞因子如IL-2和GM-CSF也被结合用在抗体上，用于靶向肿瘤细胞，改变肿瘤微环境.
重塑T细胞：T细胞免疫在肿瘤免疫里起着关键的作用。目前有两大类方法让T细胞不再受T细胞受体识别抗原的MHC分子的限制。第一类方法是双特异性抗体(bispecificantibody)，顾名思义，它既可以靶向细胞又可以结合免疫效应细胞，例如T细胞和NK细胞。目前针对CD19抗原的双特异性抗体blinatumomab已经被FDA批准，更多抗体还在研发中。第二类方法是嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcells)，即大名鼎鼎的CAR-T细胞。这类被修饰过的T细胞包含具有特异性的抗体可变区和T细胞激活的基序，能够进攻表达特异抗原的细胞。CAR-T细胞可以分裂生长，并保持肿瘤细胞特异性。目前CAR-T细胞疗法在临床实验中取得了非常显著的疗效。尽管随之而来的细胞因子风暴会带来一定危险，不过使用细胞因子的抗体可以减轻它的负面影响。CAR-T实验的经验还在不断积累，未来这一技术将渐渐成熟。
摘要：单克隆抗体制备过程中两次提到了筛选，对于两次筛选中的目的和方法许多人也存在疑惑，那么到底是如何筛选的呢？现总结如下：单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。第一次筛选:首先在（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行杂交时可能出现的情况应该先弄清楚。（一）可能的情况有：1（效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合2（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）3骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）4单个骨髓瘤细胞5单个（效应）B淋巴细胞
（二）筛选的目的---获得杂交瘤细胞（三）筛选的方法
所以通过以上方法可以选择出杂交瘤细胞，但虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同抗原决定基刺激产生的。所以产生抗体是不纯的。如果不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体。所以就有了第二次筛选。
第二次筛选要想获得单克隆抗体，所以必须得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群，由这样的细胞群产生的抗体才是真正意义的单克隆抗体。(一)筛选的目的
在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞，即得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群并且能产生所需抗体。
（二）筛选的方法
1、有限稀释法：克隆/亚克隆：分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养。然后,用ELISA检测培养上清来判断是否有产生目的抗体的单克隆生成。
2、检测每孔细胞是否产生针对目的抗原表达的抗体，所以筛选的条件是两层意思：单个细胞单孔培养保证每个孔中的细胞在产生抗体时是针对同一抗原的同一抗原决定簇产生的的，但每个孔中细胞却不一定都能产生抗体，把那些不产生抗体的细胞淘汰，对能分泌针对抗原某一决定簇抗体的阳性细胞选择下来继续克隆，从而保证大量的生产所需抗体。
3、对选择下来的细胞进行克隆方法有两种：一种可以在体外培养；一种可以一直到小鼠腹腔中增殖,即可从中提取所需要的单克隆抗体。
单克隆抗体制备的基本原理与过程原理：
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。
过程：
1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。
2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。
3）细胞融合的关键:1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。6）细胞的冻存与复苏7）大规模单克隆抗体的制备选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
①抗CD20单抗，利妥西单抗；
②抗表皮生长因子受体（EGFR)单抗，西妥昔单抗、帕尼单抗（Panitumab);
③抗Her-2单抗，曲妥珠单抗；
④抗VEGF单抗，贝伐珠单抗（Avastin)等。
