随着基因技术的蓬勃发展，单克隆抗体以其高特异性、有效型和安全性正在成为国际药品市场上的一大类新型诊断和治疗药物，在肿瘤和其他治疗领域中成为了市场的新宠。由于抗体药物在市场上的卓越表现，在这些抗体药物专利过期后催生了一类生物药物-Biosimilar（也称为Biobetter或Follow-onBIOLOGics），此类药物是在原创生物药物产品的专利保护过期以后，生产的区别于原创生物产品的类似物。[1]这种原创生物产品的类似物称为生物仿制药，生物仿制药是一种与原研药具有相同的活性成分，在剂量、剂型、给药途径、安全性、有效性、质量、治疗作用以及适应症上没有显著差异的一种仿制品。

　　生物仿制药是生物制剂的仿制品，相比化学小分子的仿制药而言，生物仿制药的制造工艺难度更大，要求的生物技术也更多。从国内的注册申报的政策来看，即便是生物仿制药也需要经过三期200例临床试验，达到不低于原研药的药效时，才能批准上市，因此具有一定的仿制难度。同样，对于单克隆抗体的生物原研药厂家，通过注册申报政策和有效的专利布局，适当延长原研药品的专利保护期并不是一件困难的工作，具体应该如何进行呢，下面作者将进行逐一分析。

　　新药研发过程时间较长，根据美国食品药品监督管理局（FDA）统计，一种新药从研发到最后投入市场平均需要12年，其中实验室研究需要占用5年时间。[2]

　　通常单克隆抗体药物的研发单位都是在设计出人源化的单克隆抗体，并证明该人源化单克隆抗体具有预计的体内体外实验效果后，就将该人源化的单克隆抗体结构申请专利保护。为了使得抗体专利获得较大的保护范围，有经验的专利代理人在撰写的时候，首先是通过限定轻链CDR区的序列，再限定重链CDR区的序列，然后限定FC区的序列这样层层限定的得到一个合理的抗体的保护范围，这样不仅保护了自己的产品，只要与自己产品相同CDR区的抗体也落入了本发明的专利范围内。然而，当申请人碰到没有经验的专利代理人，这时专利申请的权利要求仅仅保护了自己产品中的抗体序列。尽管这样，只要本专利申请能够顺利得到授权，就达到了完全保护自己产品的目的。说到这里，可能与我们通常理解的专利不大一样了，一个没有排它性的专利能够保护自己吗？如果仿制药厂家在抗体的FC段稍作改动，专利不是就不侵权了吗？

　　虽然专利不侵权，但是如果有其他企业为了避免专利的侵权，稍微改动抗体的序列，根据《药品注册管理办法》（局令第17号）附件三：生物制品注册分类及临床申报资料要求，对于与已上市销售制品结构不完全相同且国内外均未上市销售的制品（包括氨基酸位点突变、缺失，因表达系统不同而产生、消除或者改变翻译后修饰，对产物进行化学修饰等），这类药物属于注册分类中的新药，需要按照新药进行临床试验，也就是临床Ⅰ期的20例、临床Ⅱ期的100例以及临床Ⅲ期的300例试验都要完成。此外，对于这类的生物制品也是依然要完成临床前的毒理实验、药理实验和药效学实验，这样算下来，临床前和临床阶段要做的试验数目一点也不比原研单位的实验数目少，因为临床Ⅲ期是以原研药作为对照，只有不差于原研的药效才可获批，所以面临的失败风险也很高，假设成功的话，需要的研发时间也要12年。

　　单克隆抗体结构的专利申请工作通常也是在临床前就已经申请了专利，距离真正的药品上市还有将近十年的时间，那么对于20年的专利保护期而言，药品上市后能够获得保护的时间只有10年甚至更短的时间了，接下来，对于新药研发单位而言，还能够申请哪些专利来有效地保护抗体新药呢？

　　另外，与化学药品制备方法不同的是，生物药品在制备中需要的原料是宿主细胞株，也要通过专利将宿主细胞株保护起来，而且作为与抗体结构同等重要的地位进行保护。这主要源于《药品注册管理办法》（局令第17号）附件三：生物制品注册分类及申报要求，对于与已上市销售制品制备方法不同的制品（例如不同的表达体系、宿主细胞等），即注册分类中的第10类生物制品在临床上按照新药进行临床试验，也就是说，临床Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期实验一个都不能少，临床前在药理毒理方面的试验能够比原研生物药少一点，其他的药学实验也是一样的。

　　在生物制品宿主细胞株的这类专利中，通常会涉及到生物抗体的表达方法，也是我们所说的药品制备方法。生物药品的制备方法通常在药品申报临床前形成。有时，由于药品进入临床，生物药品需要扩大生产，原有的制备方法有时需要重新调整，形成了新的制备方法。这时，对于专利申请来说，如果在临床前就将制备方法申请了专利，后续再申请改进工艺的专利申请时，往往会出现在先申请影响再后申请的专利创造性，导致扩大生产后的制备方法难以获得专利授权。

　　为了避免以上情况的发生，建议在先的制备方法通过公司机密的方式进行保护。等到在后的制备方法确定下来，将在先和在后的两种制备方法同时申请专利。由于在后制备方法的形成时间已经是药品的临床试验期了，所以通过制备方法专利还能够起到通过专利延长药品保护时间的目的。

　　原研生物制药单位在做这类专利申请的时候，建议把制备抗体专利申请安排在临床I期试验结束或者临床Ⅱ期试验中，大约在抗体结构专利申请之后的5-7年之间。为什么选择在这个时间点呢？根据药品研发经验，临床Ⅱ期和临床Ⅲ期通常的研发周期在五年左右，这时也正好是方法专利从提交到授权的周期。一方面刚好在临床Ⅲ期试验结束后，产品拿到新药证书，专利也正好获得授权；另一方面，如果在临床Ⅲ期实验结果非常好，原研单位对外公开产品信息的时候，重要的专利还在审查期间，那么该专利申请会面临很多的公众意见的情况，这些都会影响此类专利申请的授权。

　　在做生物药品宿主细胞株、制备方法这类专利申请的时候，还需要考虑未来药品的质量标准。原研单位也是以后该药品的质量标准制定者，仿制药厂家如果无法达到该标准，仿制药品也无法得到批准。因此，能够实现未来上市药品质量标准的制备方案都要在该专利中保护起来。举个例子，对于实现原研药品中“杂质含量控制在某一范围内”是该药品以后的行业标准，那么有将“该杂质含量控制在某个范围内”的药品制备方案都要在该专利申请的权利要求中保护起来。

　　即便有的企业为了绕开过以上药品宿主细胞株的专利，另辟其他制备方法的工艺路线，也相当于一个新药的研发周期。

　　此外，对于原研的生物制药单位而言，以上的宿主细胞株、制备方法专利申请在撰写时要结合向国家药监局正式申报材料中的记录来撰写，比如与申报材料相同的宿主细胞株、载体的构建方法、表达方式等都要通过该专利申请的权利要求保护起来。另外，宿主细胞株要记得去保藏。[3]

　　说完抗体结构专利和宿主细胞株专利申请，那么接下来说一下抗体制剂的专利了。生物药品与化学药品不同，可选择的制药辅料很少，尽管如此，有的生物药品为了克服粘度过大、稳定性差等缺陷，还是会在制药辅料上做一些研究，从而得到一个稳定性好，使用效率高的制剂。这时的制剂在申请专利时，因为有了以上这些与现有技术不同的地方，专利申请具有创造性，也能得到授权。建议这类制剂专利申请作为整个生物药品专利布局中的一部分进行申请。从产品的研发流程来看，制剂技术在临床前就已经完成了，但是为了通过制剂专利起到延长药品专利保护期的目的，建议制剂的相关专利申请在临床Ⅱ期结束或者临床Ⅲ前提交，尽量保证在产品获得新药证书前，得到专利授权。

　　制剂专利申请撰写时的要求类似于宿主细胞株专利申请，需要考虑未来药品的质量标准。首先向国家药监局提交正式申报材料中的抗体制剂的技术方案必须包括在该制剂的权利要求中。此外，为了扩大保护范围，申请人还可以写一些自己没有用到的，但是能够达到同样质量标准制剂的技术方案写入专利申请的权利要求中。比如说：为了实现与原研药品生物利用度的相同标准，需要的其他技术方案也要进行专利保护。可以用一篇专利申请保护，也可以用多个外围专利申请把这些技术方案保护进去。

　　仿制药企业为了规避专利，必然要在制剂上进行绕道，绕道形成的新制剂在《药品注册管理办法》中的分类分到了13类，按照《药品注册管理办法》，注册分类13的制品也是需进行Ⅲ期临床试验，临床试验例数不少于200例。

　　对于抗体的原研单位而言，因为自己的产品是第一个进入市场的，所以，相关的行业标准也都是自己制定的。如果抗体制剂的专利保护方案能够和自己制定的行业标准捆绑在一起，那么对于仿制药企业而言，冲破原研药企在整个制剂专利布局上的技术壁垒，再经过200例临床试验，需要达到不差于原研药品的临床效果难度非常大。因此，作为整个单克隆抗体药物专利布局最后的一个制剂专利，又一次地将药品的专利保护时间得以延长。

　　总结

　　单克隆抗体药物由于制备生产难度大，在《药品注册管理办法》中对于仿制药和新药在临床和临床试验前进行了严格的规定，因此，对于原研单克隆抗体制药企业，做好在抗体结构、宿主细胞株、抗体制剂三个方面的专利布局，就能够将自己的药品得到有效地专利保护，并通过专利将自己产品的专利保护期有效延长。（作者：托娅）

　　注释：

　　[1]《单克隆抗体药物与研发趋势》GE单克隆抗体手册。

　　[2]王友同，吴梧桐，吴文俊我国生物制药产业的过去、现在和将来药物生物技术2010,17（1）：1-14

　　[3]《用于专利程序的微生物保藏办法公告》中国专利局公告（第8号）

转自中国知识产权网，http://www.cnipr.com/yysw/zscqzlygl/201611/t20161125_199955.htm（原文责任编辑：ShanYuqiu）

实验外包单克隆抗体在现代生物医学中的作用越来越大，它不仅被广泛应用于生化和免疫检测，而且治疗癌症和自体免疫疾病的单抗药物也逐渐批准上市。因此单抗的制备和筛选具有其内在的重要性。

动物免疫

取4只6周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射抗原（20μg/只），第一次免疫与等量弗氏完全佐剂乳化，0.2mL/只；两周后进行第二次免疫，抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，皮下注射，0.2mL/只；两周后进行第三次免疫，免疫方法及剂量同第二次免疫。第三次免疫一周后，小鼠眼眶采血测其效价，第三次免疫两周后，选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的抗原加强免疫，3d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。

细胞融合

1骨髓瘤细胞的准备

选择生长状态良好的SP2/0细胞，覆盖瓶底80％时弃上清，以不完全培养基洗涤一次后，用l0mL不完全培养基将细胞轻轻吹下。

2脾淋巴细胞的准备

取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈脱臼将小鼠致死，用75%酒精消毒体表10min，随即放入超净台内的解剖板上，腹部朝上，四肢固定；无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织；随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。用研磨棒挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。

3饲养细胞的制备

取一只成熟健康的ICR小鼠，摘眼球采血作为阴性血清，颈脱臼处死；体表消毒和固定后，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜；用l0mL注射器，12#针头，吸取10mLHAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入己准备好的容器中。

4融合

将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的融合管中，1000rpm离心10min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37°C水浴中45s内缓慢加入1mL预热的PEG-1500到融合管中，边加边轻轻摇匀；随即在90s内先慢后快滴加30mL37°C预热的不完全DMEM培养基，使PEG稀释而失去作用，37°C静置10min，1000rpm离心10min；弃上清，用60mLHAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞；分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37°C6%CO2培养箱内培养；5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10d后用预热的HT换出HAT；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行ELISA检测,两次检测结果为阳性设为阳性克隆孔。

杂交瘤细胞的克隆化及建株

采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化。阳性细胞计数，取100个细胞放入5mL含饲养细胞的培养液中，即20个细胞/mL，100μL/孔滴加于96孔细胞培养板，即每孔1个细胞：再将余下的细胞悬液倍比稀释，细胞数为10个/mL，100μL/孔滴加于96孔细胞培养板，即每孔0.5个细胞。第8～9d时，肉眼可见细胞克隆，对出现单个细胞克隆的孔再按筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA方法进行筛选。连续进行三次以上亚克隆，判为阳性的细胞株扩大培养，建株冻存。

鼠单克隆抗体的亚类是如何区分的？

小鼠IG1，2A,2B,3AD等亚类的区别是根据什么区分的