[[5x100µl,ABP-SC-RREXR1]]
BriefIntroduction:
ABP-SC-RREXR1,Typically~1x10^8TU/ml,5vials,10^7TUin0.1mlpervial.
Rex1promoter-fluorescentprotein(FP)reportersaresaidtodisplayspecificexpressionunderundifferentiatedstates.Theselentiviralparticlesexhibithighlentiviraltiter,reliableexpressionandareself-inactivatingvectors.
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(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代,只要不发生细胞株的基因突变,就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)可以用相对不纯的抗原,获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体,所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,如IRMA和ELISA等。
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。
2.单克隆抗体的局限性
(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应,所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。
(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。
(3)制备技术复杂,而且费时费工,所以单克隆抗体的价格也较高。向左转|向右转
◆ 治疗:每公斤体重0.5ml,腹股沟内侧肌肉注射,连用3天;严重者酌情加倍.
◆ 预防:体重10公斤以下犬,每只肌肉注射1-3ml;体重10-25公斤犬,每只肌肉注射3-5 ml;体重25公斤以上犬,每只肌肉注射5-10ml;可保护犬一周内免受犬细小病毒的感染。
在单克隆抗体制备中,首先进行的就是抗原的设计与合成,这是制备单抗成功与否的关键。因为产生抗体的特异性与亲合性是与抗原密切相关的,合成的抗原如果可以将所需要的抗原决定簇充分暴露出来,那么机体更容易识别抗原决定簇,从而免疫的动物所产生的抗体自然会在特异性和亲合力上最大程度的与抗原决定簇拟合。所以,在制备单抗的过程中,设计并合成抗原尤为重要。
对于小分子药物抗原的设计与合成,园子里已经有很多战友进行了讨论和交流,下面,我再将自己所了解的结合战友们的经验,作以下总结,由于能力有限,有总结的不到位的地方,还请战友们指出来,不足的地方,大家一起讨论补充。
一、完全抗原的设计
大家都知道,完全抗原的合成主要是在半抗原的基础上连接上蛋白质形成的,主要原因在于,半抗原属于小分子药物,只有反应原性,但不具有免疫原性,只有与载体(通常为蛋白质,也有多肽)偶连后形成完全抗原,才具有免疫原性,进入动物体内后才会产生抗体。对于半抗原而言(大多数为小分子药物),不同种类药物有不同的空间结构,究竟如何设计合成完全抗原呢?
1、分析药物结构。以磺胺对甲氧嘧啶(SMD)为例,磺胺药物的母体为对氨基苯磺酰胺,大部分的磺胺药是在N1端连接了取代基,N4端为氨基。也就是说各种药物由于N1端取代基的不同从而具有不同的活性,那么对于制备抗SMD的抗体而言,其抗原的合成就可以选择在N4端连接蛋白,将N1端的对甲嘧啶环暴露出来,这样免疫后就可以使机体产生针对SMD的抗体。如果是在N1端连接,那么半抗原突出的是磺胺类药物共有的对氨基磺酸母核,这样制备出的抗体其交叉性就会较大,更易识别磺胺类的其他药物了。
所以,在设计之前应该认真分析需要合成的抗原结构,找出起抗原活性的位置及其抗原决定簇的位置。
2、设计合成的原则:免疫半抗原设计的基本原则是免疫半抗原与载体连接后在结合抗原中能最大程度保持和突出待测物的特征结构,特别是立体结构。
3、“间隔臂”。免疫半抗原一般有几结构组成:待测物特征结构、用于连接特征结构和载体的间隔分子和末端的活性基团。间隔分子又称为”间隔臂“。免疫系统对位于载体远端的半抗原部分识别能力最强,所以间隔臂的位置选择十分重要。间隔臂的位置结构最能体现一种免疫半抗原的设计意图。一般我们可以直接利用待测物中非特征的结构部分作为间隔臂或自行构建间隔臂。通常间隔臂为非极性,除供偶连合成的基团外不应含有其他高免疫活性的结构,如苯环、杂环、饱和链烃等。
有的人认为,引入间隔臂对抗体的产生反而有干扰,假若间隔臂较长,或立体结构较特征性,则很容易产生针对间隔臂的“桥抗体“,在单抗的筛选过程中会产生干扰。但是,有的药物由于分子量小、空间结构简单,很难通过单纯的连接蛋白产生高效特异的抗体,所以,引入间隔臂会有利于抗体的产生。
二、完全抗原的合成:
常用的载体蛋白中,供连接的主要基团为游离氨基、游离羧基、酚基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基、精氨酸的胍基等。但由于蛋白质载体参与反应的基团差不多相同,所以连接方法主要取决于半抗原活性基团种类。
1、含羧基的半抗原:主要有混合酸酐法、碳二亚胺法、N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法(NHS)。该法的优点在于不含有间隔臂,可以排除“桥抗体“的产生。
2、含氨基的半抗原:有戊二醛法(含有戊二醛,容易产生“桥抗体“)、重氮法(不含间隔臂)。
3、含羟基的半抗原:主要有琥珀酸酐法、卤代羧酸法。
此外,还有含巯基、醛基或酮基、硝基的半抗原,其偶连方法这里不再赘述,大家可以参考洪孝庄的《蛋白质连接技术》。、
三、完全抗原合成的鉴定:
可以采用紫外分光光度法、红外光谱法和免疫实验的方法来进行鉴定偶连反应是否成功。
半抗原结合比的计算:即指半抗原与载体的连接比。一般认为,半抗原结合比过高或过低均影响抗体生成,以5-15为宜。但,有些研究者的实验结果表明,半抗原结合比的大小对诱导抗体产生无决定性的影响。可以通过反应原料中蛋白质与半抗原的摩尔比和溶液的PH来控制结合比。
半抗原结合比=(ε结合物-ε载体)/ε半抗原
(ε为某波长的摩尔吸光系数,取载体、半抗原和结合物均有较强吸收时的波长;ε载体、ε半抗原可预先用纯品检测得到)
以下整理了园子里一些小分子药物抗原设计与合成方法的帖子,大家可以参考:
【求助】关于莱克多巴胺的人工抗原合成。特急!(戊二醛法)
[交流]单抗讨论小组话题三:小分子抗原的单抗制备策略
(请教)人工抗原怎么制备
【讨论】为什么小分子一般连接BSA免疫偶不是连其他蛋白啊
【求助】l氯霉素半抗原的合成
【讨论】氯霉素人工抗原偶联率的计算
【求助】氯霉素人工抗原制备过程中的问题
Re:【求助】请教:戊二醛法合成完全抗原时遇到的问题(合成SMM)
Re:【交流】小分子药物的蛋白质连接技术(精华帖)
(请教)如何产生较高效价抗青霉素抗体
Re:【求助】重氮法制备人工抗原遇到的问题
(1)鼠源单克隆抗体的生产应用的动物细胞工程技术有动物细胞培养、动物细胞融合等.
(2)据图可知,免疫原性的产生主要与抗体的 C区有关.
(3)基因嵌合表达载兼具有淋巴细胞和体细胞的特点,体转染成功的细胞应该具有的特点是:分泌抗体和无限增殖能力.
(4)嵌合抗体的生产属于蛋白质工程范畴.图示中的嵌合抗体具有特异性,能比较有效的治疗肿瘤.
1.材料
(1) 细胞:取对数生长期的细胞。
(2) 10%二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器,而又被高压所破坏,所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品,无菌):含10%二甲基亚砜、20%灭活胎牛血清,70%RPMI—1640液。
(3) 20%FCS—1640培养液:含青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml。
(4) 灭菌的2ml安瓶等
2.操作方法
(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液,加入10%FCS—1640液,使细胞悬浮。
(3) 1 000r/min离心10min,去上清。细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制成悬液,使成1.0×107细胞/ml。
(3) 取样,台盼兰染色,计数活细胞,应在95%以上。
(4) 用器将细胞分装安瓶,每瓶0.5ml~1.0ml,熔封安瓶。
(5) 放4℃ 2h。
(6) 放液氮罐气态部分(-70℃)15h。
(7) 转入液氮部分。
复苏
1.从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。
2.无菌操作打开安瓶,取出细胞悬液,转入组织培养瓶。
3.逐滴缓慢加入20%FCS-1640培养液3.5ml,这个过程延续3min。
4.5%CO2饱和湿度,37℃培养。
5.4h后弃去培养液上清,加入新鲜的20%FCS-1640培养液。
6.继续培养,换液,以至形成单层。
首先是一个抗体药物的releaselotstest:
?ProteinConcentration----------------------70.9mg/mL[63.0-77.0]
?Potency----------------------100%[80-125%]
?ID(immunoassay)----------------------Pass
?SE-HLC-----------------------MP:99.8%,HMW:0.2%,LMW:0.0%[MP≥99%]
?CE-SDS,reduced----------------------HC+LC:98.9%,HC:66.8%LC:32.1%[LC+HC≥98%]
?CEX-HPLC-----------------------MP:89.6%,Acidic:2.7%,Basic:7.7%[≥80%]
?CEX-HPLCID-----------------------Pass
?Osmolality-----------------------314mOsm/kg[300±50]
?pH----------------------5.2at24.6°C[5.0–5.4]
?Appearance-----------------------Report
?Volume-----------------------1.2mL(average1.1525mL,n=5)[≥1mL]
?Sub-visIBLeParticulate----------------------29particles/container≥10μm[nomorethan6000]
3particles/container≥25μm[nomorethan600]
?Sterility--------------------------------------Pass
?BacterialEndotoxin-----------------------<0.2EU/mL[≤5.0]
?CHOPELISA-----------------------4.4ppm
?Protein-AELISA-----------------------<0.5ppm
?DNAQPCR-----------------------<1pg/mg
以上各项指标基本是反映了对抗体药物最终产品的质量要求,用到的一些方法也比较的明了,可以作为抗体药物开发的参考。
版主zhulikou431留言:
加分鼓励有价值的话题。
单克隆抗体是利用了瘤细胞的无限增殖,利用了淋巴细胞能产生单一抗体的特征。记忆细胞是不能产生抗体的,需要抗原刺激才能增殖、分化为浆细胞,浆细胞才能产生抗体。
体组织标本抗选种兔抗鼠抗类抗抗体
二抗针抗源抗兔抗二抗要选鼠抗兔或者羊抗兔类抗兔抗体(注意句抗兔抗基础抗鼠抗二抗要选抗鼠抗体)
在过去的20年,单克隆抗体逐渐成为癌症治疗中的支柱。从最初应用价值有限的鼠源单抗到最近新的CAR-T技术,研究者们不停地摸索改进创新。最近一期的《NatureReviewsCancer》杂志刊登了基于单抗的癌症疗法综述。文章从四个方面介绍了单抗在癌症治疗里的用途。
癌细胞靶向疗法:恶性肿瘤细胞表面表达着一些异于普通健康细胞的抗原,这些抗原可以作为单克隆抗体的良好靶点。体外与动物体内的实验显示,针对这些靶点的抗体可以引起细胞的凋亡,并通过补体介导的细胞毒性(complement-mediatedcytotoxicity,CMC)以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)杀死靶细胞。但是在不同临床实验中,具体是哪一种机制更为重要还有待研究.
改变宿主体内应答:VEGF等血管内皮生长因子促进肿瘤内血管生长(angiogenesis),为肿瘤提供优越的生长环境。因此通过抑制VEGF来抑制血管生成的抗体如Bevacizumab等成为有效的抗癌药物。但由于其不能直接作用于癌细胞,此类抗体药物通常与其他具有细胞毒性的药物结合使用。另一个方法是T细胞检验点阻断(Tcellcheckpointblockade)。在T细胞免疫中,配体和受体的共调控在肿瘤特异性T细胞的激活和抑制中起着重要作用。精确控制的T细胞检验点影响免疫系统的反应,避免免疫系统过度激活。抑制这些检验点的单抗被叫做检验点阻断抗体,它们可以诱导更强的肿瘤免疫反应,使反应维持更久的时间。目前常用的抗体包括阻断CTLA4的Ipilimumab和PD1的抗体pembrolizumab和nivolumab。PD1抗体在何杰金淋巴瘤的初期临床实验中显示出很好的效果.
运输具有细胞毒性的分子:近年来,“智能炸弹”(smartbomb)被用来描述这一系列向癌细胞运输细胞毒性分子的单抗。这些分子包括放射免疫偶联物,具有细胞毒性的小分子以及免疫系统里的细胞因子。放射性元素被用于标记抗体,进行肿瘤的诊断和治疗。淋巴瘤是较为适合放射性疗法的癌症,目前被FDA批准的药物有ibritumomabtiuxetan和tositumomab。抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugates)是最近研发的极具前景的抗癌药物。它将带有细胞毒性的药物和具有特异性的抗体偶联,提高了特异性同时更好地杀死肿瘤细胞。此外免疫细胞因子如IL-2和GM-CSF也被结合用在抗体上,用于靶向肿瘤细胞,改变肿瘤微环境.
重塑T细胞:T细胞免疫在肿瘤免疫里起着关键的作用。目前有两大类方法让T细胞不再受T细胞受体识别抗原的MHC分子的限制。第一类方法是双特异性抗体(bispecificantibody),顾名思义,它既可以靶向细胞又可以结合免疫效应细胞,例如T细胞和NK细胞。目前针对CD19抗原的双特异性抗体blinatumomab已经被FDA批准,更多抗体还在研发中。第二类方法是嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcells),即大名鼎鼎的CAR-T细胞。这类被修饰过的T细胞包含具有特异性的抗体可变区和T细胞激活的基序,能够进攻表达特异抗原的细胞。CAR-T细胞可以分裂生长,并保持肿瘤细胞特异性。目前CAR-T细胞疗法在临床实验中取得了非常显著的疗效。尽管随之而来的细胞因子风暴会带来一定危险,不过使用细胞因子的抗体可以减轻它的负面影响。CAR-T实验的经验还在不断积累,未来这一技术将渐渐成熟。
先说骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合,共有3种情况,B淋巴和B淋巴融合,B淋巴和骨髓瘤细胞融合,骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合
第一次筛选是为了筛选出能无限增殖的细胞,这只有两种情况:
1、经过免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞
2、骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞
第二次是为了筛选出能产生单克隆抗体的细胞
那么只可能是,经过免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞。
所以有两次筛选