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大家好，最近在做单抗，里面有些问题一直想不通，我想请大神帮忙一下，想问一下饲养细胞加少了是大概多少，我一直6周龄的balb/C，刚拿回来就取饲养细胞了，然后取了3毫升，注射到60毫升的HAT中铺了六块板子，这个量多么，么有细胞计数，至今细胞计数不是很会，去想问你们第二天去看板子是时候，底下会有雾一样的细胞么，细胞多的地方你们的液体上清会有点变色么，要一点不变色的是好的，还是细胞上清稍微变色是正常的呢谢谢大神指导
希望得到前辈们的回答。非常感谢！
1．材料
(1) 细胞：取对数生长期的细胞。
(2) 10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。
(3) 20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
(4) 灭菌的2ml安瓶等
2．操作方法
(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。
(3) 1 000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞／ml。
(3) 取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。
(4) 用器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。
(5) 放4℃ 2h。
(6) 放液氮罐气态部分（-70℃）15h。
(7) 转入液氮部分。
复苏
1．从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。
2．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。
3．逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。
4．5％CO2饱和湿度，37℃培养。
5．4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。
6．继续培养，换液，以至形成单层。
我先开个头
泊落沙姆188，土温80
◆ 治疗:每公斤体重0.5ml,腹股沟内侧肌肉注射,连用3天；严重者酌情加倍.
◆ 预防:体重10公斤以下犬,每只肌肉注射1-3ml；体重10-25公斤犬,每只肌肉注射3-5 ml；体重25公斤以上犬,每只肌肉注射5-10ml；可保护犬一周内免受犬细小病毒的感染。
求助：看了许多文献，对于免疫小鼠的抗原剂量以及方法各不相同，所以发帖问问大家制备单抗的详细过程，谢谢大家
首先是一个抗体药物的releaselotstest：
?ProteinConcentration----------------------70.9mg/mL[63.0-77.0]
?Potency----------------------100%[80-125%]
?ID(immunoassay)----------------------Pass
?SE-HLC-----------------------MP:99.8%,HMW:0.2%,LMW:0.0%[MP≥99%]
?CE-SDS,reduced----------------------HC+LC:98.9%,HC:66.8%LC:32.1%[LC+HC≥98%]
?CEX-HPLC-----------------------MP:89.6%,Acidic:2.7%,Basic:7.7%[≥80%]
?CEX-HPLCID-----------------------Pass
?Osmolality-----------------------314mOsm/kg[300±50]
?pH----------------------5.2at24.6°C[5.0–5.4]
?Appearance-----------------------Report
?Volume-----------------------1.2mL(average1.1525mL,n=5)[≥1mL]
?Sub-visIBLeParticulate----------------------29particles/container≥10μm[nomorethan6000]
3particles/container≥25μm[nomorethan600]
?Sterility--------------------------------------Pass
?BacterialEndotoxin-----------------------<0.2EU/mL[≤5.0]
?CHOPELISA-----------------------4.4ppm
?Protein-AELISA-----------------------<0.5ppm
?DNAQPCR-----------------------<1pg/mg
以上各项指标基本是反映了对抗体药物最终产品的质量要求，用到的一些方法也比较的明了，可以作为抗体药物开发的参考。
版主zhulikou431留言:
加分鼓励有价值的话题。
在过去的20年，单克隆抗体逐渐成为癌症治疗中的支柱。从最初应用价值有限的鼠源单抗到最近新的CAR-T技术，研究者们不停地摸索改进创新。最近一期的《NatureReviewsCancer》杂志刊登了基于单抗的癌症疗法综述。文章从四个方面介绍了单抗在癌症治疗里的用途。
癌细胞靶向疗法：恶性肿瘤细胞表面表达着一些异于普通健康细胞的抗原，这些抗原可以作为单克隆抗体的良好靶点。体外与动物体内的实验显示，针对这些靶点的抗体可以引起细胞的凋亡，并通过补体介导的细胞毒性(complement-mediatedcytotoxicity,CMC)以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcellularcytotoxicity,ADCC)杀死靶细胞。但是在不同临床实验中，具体是哪一种机制更为重要还有待研究.
改变宿主体内应答：VEGF等血管内皮生长因子促进肿瘤内血管生长(angiogenesis)，为肿瘤提供优越的生长环境。因此通过抑制VEGF来抑制血管生成的抗体如Bevacizumab等成为有效的抗癌药物。但由于其不能直接作用于癌细胞，此类抗体药物通常与其他具有细胞毒性的药物结合使用。另一个方法是T细胞检验点阻断(Tcellcheckpointblockade)。在T细胞免疫中，配体和受体的共调控在肿瘤特异性T细胞的激活和抑制中起着重要作用。精确控制的T细胞检验点影响免疫系统的反应，避免免疫系统过度激活。抑制这些检验点的单抗被叫做检验点阻断抗体，它们可以诱导更强的肿瘤免疫反应，使反应维持更久的时间。目前常用的抗体包括阻断CTLA4的Ipilimumab和PD1的抗体pembrolizumab和nivolumab。PD1抗体在何杰金淋巴瘤的初期临床实验中显示出很好的效果.
运输具有细胞毒性的分子：近年来，“智能炸弹”(smartbomb)被用来描述这一系列向癌细胞运输细胞毒性分子的单抗。这些分子包括放射免疫偶联物，具有细胞毒性的小分子以及免疫系统里的细胞因子。放射性元素被用于标记抗体，进行肿瘤的诊断和治疗。淋巴瘤是较为适合放射性疗法的癌症，目前被FDA批准的药物有ibritumomabtiuxetan和tositumomab。抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugates)是最近研发的极具前景的抗癌药物。它将带有细胞毒性的药物和具有特异性的抗体偶联，提高了特异性同时更好地杀死肿瘤细胞。此外免疫细胞因子如IL-2和GM-CSF也被结合用在抗体上，用于靶向肿瘤细胞，改变肿瘤微环境.
重塑T细胞：T细胞免疫在肿瘤免疫里起着关键的作用。目前有两大类方法让T细胞不再受T细胞受体识别抗原的MHC分子的限制。第一类方法是双特异性抗体(bispecificantibody)，顾名思义，它既可以靶向细胞又可以结合免疫效应细胞，例如T细胞和NK细胞。目前针对CD19抗原的双特异性抗体blinatumomab已经被FDA批准，更多抗体还在研发中。第二类方法是嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcells)，即大名鼎鼎的CAR-T细胞。这类被修饰过的T细胞包含具有特异性的抗体可变区和T细胞激活的基序，能够进攻表达特异抗原的细胞。CAR-T细胞可以分裂生长，并保持肿瘤细胞特异性。目前CAR-T细胞疗法在临床实验中取得了非常显著的疗效。尽管随之而来的细胞因子风暴会带来一定危险，不过使用细胞因子的抗体可以减轻它的负面影响。CAR-T实验的经验还在不断积累，未来这一技术将渐渐成熟。
摘要：单克隆抗体制备过程中两次提到了筛选，对于两次筛选中的目的和方法许多人也存在疑惑，那么到底是如何筛选的呢？现总结如下：单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。第一次筛选:首先在（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行杂交时可能出现的情况应该先弄清楚。（一）可能的情况有：1（效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合2（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）3骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）4单个骨髓瘤细胞5单个（效应）B淋巴细胞
（二）筛选的目的---获得杂交瘤细胞（三）筛选的方法
所以通过以上方法可以选择出杂交瘤细胞，但虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同抗原决定基刺激产生的。所以产生抗体是不纯的。如果不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体。所以就有了第二次筛选。
第二次筛选要想获得单克隆抗体，所以必须得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群，由这样的细胞群产生的抗体才是真正意义的单克隆抗体。(一)筛选的目的
在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞，即得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群并且能产生所需抗体。
（二）筛选的方法
1、有限稀释法：克隆/亚克隆：分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养。然后,用ELISA检测培养上清来判断是否有产生目的抗体的单克隆生成。
2、检测每孔细胞是否产生针对目的抗原表达的抗体，所以筛选的条件是两层意思：单个细胞单孔培养保证每个孔中的细胞在产生抗体时是针对同一抗原的同一抗原决定簇产生的的，但每个孔中细胞却不一定都能产生抗体，把那些不产生抗体的细胞淘汰，对能分泌针对抗原某一决定簇抗体的阳性细胞选择下来继续克隆，从而保证大量的生产所需抗体。
3、对选择下来的细胞进行克隆方法有两种：一种可以在体外培养；一种可以一直到小鼠腹腔中增殖,即可从中提取所需要的单克隆抗体。
单克隆抗体制备的基本原理与过程原理：
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。
过程：
1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。
2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。
3）细胞融合的关键:1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。6）细胞的冻存与复苏7）大规模单克隆抗体的制备选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
