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第一次筛选好像是用选择培养基吧
那第二步呢？
谢谢

-18摄氏度以下冷冻保存,有效期2年；开瓶后保存于4摄氏度,一周内有效.忌反复冻融.

单克隆抗体的产生用的是浆细胞，认真思考一下教材，你就明白了，因为获得
单克隆抗体是利用了瘤细胞的无限增殖，利用了淋巴细胞能产生单一抗体的特征。记忆细胞是不能产生抗体的，需要抗原刺激才能增殖、分化为浆细胞，浆细胞才能产生抗体。

单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。
单克隆抗体这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨: ①蛋白质的精细结构；②淋巴细胞亚群的表面新抗原；③组织相容性抗原；④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；⑤肿瘤的定位和分类；⑥纯化微生物和寄生虫抗原；⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法 (“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位.。
因此，单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。

单抗制备中SP/20和小鼠脾细胞融合是的比例是1:5左右，但是融合完后铺96孔细胞板，怎样才能保证最后每空长出一个细胞团？求大神指点，

最近因为项目合作关系，看了很多抗体的糖基化和质量检测方面的文献，收获真的是很大，看我们生物制药版的人气真是不旺，所以发点心得和收获。当然还有一个目的就是希望能够把真正懂得人给挖出来，大家能够像别的版里一样，互相交流。
首先是一个抗体药物的releaselotstest：
?ProteinConcentration----------------------70.9mg/mL[63.0-77.0]
?Potency----------------------100%[80-125%]
?ID(immunoassay)----------------------Pass
?SE-HLC-----------------------MP:99.8%,HMW:0.2%,LMW:0.0%[MP≥99%]
?CE-SDS,reduced----------------------HC+LC:98.9%,HC:66.8%LC:32.1%[LC+HC≥98%]
?CEX-HPLC-----------------------MP:89.6%,Acidic:2.7%,Basic:7.7%[≥80%]
?CEX-HPLCID-----------------------Pass
?Osmolality-----------------------314mOsm/kg[300±50]
?pH----------------------5.2at24.6°C[5.0–5.4]
?Appearance-----------------------Report
?Volume-----------------------1.2mL(average1.1525mL,n=5)[≥1mL]
?Sub-visIBLeParticulate----------------------29particles/container≥10μm[nomorethan6000]
3particles/container≥25μm[nomorethan600]
?Sterility--------------------------------------Pass
?BacterialEndotoxin-----------------------<0.2EU/mL[≤5.0]
?CHOPELISA-----------------------4.4ppm
?Protein-AELISA-----------------------<0.5ppm
?DNAQPCR-----------------------<1pg/mg
以上各项指标基本是反映了对抗体药物最终产品的质量要求，用到的一些方法也比较的明了，可以作为抗体药物开发的参考。
版主zhulikou431留言:
加分鼓励有价值的话题。

1.对小鼠注射特定的抗原蛋白,使小鼠产生免疫反应；2.得到相应的B淋巴细胞；3.将小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合,再用特定的选择培养基进行筛选；4.在该培养基上,未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡,只有融合的杂种细胞才能生长（这种杂种细胞的特点是既能迅速大量繁殖又能产生专一的抗体）；5.对上述杂交瘤细胞还需进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选,就可获得足量的能分泌所需抗体的细胞；6.最后,将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养,或注射到小鼠腹腔内增殖,这样,从细胞培养液或小鼠腹水中,就可以提取出大量的单克隆抗体了!
向左转|向右转

临床常用的单克隆抗体靶向药物包括：
①抗CD20单抗，利妥西单抗；
②抗表皮生长因子受体（EGFR)单抗，西妥昔单抗、帕尼单抗（Panitumab);
③抗Her-2单抗，曲妥珠单抗；
④抗VEGF单抗，贝伐珠单抗（Avastin)等。

兔抗抗体源兔针蛋白抗体

体组织标本抗选种兔抗鼠抗类抗抗体

二抗针抗源抗兔抗二抗要选鼠抗兔或者羊抗兔类抗兔抗体（注意句抗兔抗基础抗鼠抗二抗要选抗鼠抗体）

摘要：单克隆抗体制备过程中两次提到了筛选，对于两次筛选中的目的和方法许多人也存在疑惑，那么到底是如何筛选的呢？现总结如下：单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。第一次筛选:首先在（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行杂交时可能出现的情况应该先弄清楚。（一）可能的情况有：1（效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合2（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）3骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）4单个骨髓瘤细胞5单个（效应）B淋巴细胞
（二）筛选的目的---获得杂交瘤细胞（三）筛选的方法
所以通过以上方法可以选择出杂交瘤细胞，但虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同抗原决定基刺激产生的。所以产生抗体是不纯的。如果不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体。所以就有了第二次筛选。

第二次筛选要想获得单克隆抗体，所以必须得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群，由这样的细胞群产生的抗体才是真正意义的单克隆抗体。(一)筛选的目的
在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞，即得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群并且能产生所需抗体。
（二）筛选的方法
1、有限稀释法：克隆/亚克隆：分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养。然后,用ELISA检测培养上清来判断是否有产生目的抗体的单克隆生成。

2、检测每孔细胞是否产生针对目的抗原表达的抗体，所以筛选的条件是两层意思：单个细胞单孔培养保证每个孔中的细胞在产生抗体时是针对同一抗原的同一抗原决定簇产生的的，但每个孔中细胞却不一定都能产生抗体，把那些不产生抗体的细胞淘汰，对能分泌针对抗原某一决定簇抗体的阳性细胞选择下来继续克隆，从而保证大量的生产所需抗体。
3、对选择下来的细胞进行克隆方法有两种：一种可以在体外培养；一种可以一直到小鼠腹腔中增殖,即可从中提取所需要的单克隆抗体。

单克隆抗体制备的基本原理与过程原理：
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。
过程：
1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。
2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。
3）细胞融合的关键:1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。6）细胞的冻存与复苏7）大规模单克隆抗体的制备选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。

为了克服鼠源性单克隆抗体存在的问题，科学家利用基因工程方法使小鼠的抗体人源化。通过构建人一鼠嵌合抗体，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体。1984年Morrison等人成功地构建了第一个人鼠单克隆抗体即嵌合抗体。嵌合抗体指的是鼠单克隆抗体的可变区基因被人抗体的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码并在合适的宿主细胞中表达而产生的单克隆抗体。
基本原理:抗体分了的特异性识别、抗原结合由轻链和重链可变区决定的，而异源蛋白产生的人抗鼠抗体反应的主要是抗体恒定区。将小鼠单抗恒定区用人源化恒定区代替而拼接成嵌合抗体，使其重链和轻链的可变区来白小鼠，恒定区来自人源性。简言之嵌合抗体既具有抗原结合特异性，又大大地降低了鼠单抗的异源性。嵌合抗体是基因工程抗体最早研究出来的一种抗体，在肿瘤治疗和诊断方法已被广泛的应用。虽然嵌合抗体在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应，但仍存在一少部分鼠源成分。这直接导致抗体被迅速清除，从而降低治疗效果。 1.改形抗体
1986年，Jones等人成功构建了第一个改形抗体，又称CDR移植抗体和人源化抗体，指将鼠单抗可变区中互补决定区(CDR)序列取代人源抗体相应CDR序列，重组构成既具有鼠源性单抗特异性，又保持人抗体亲和力的CDR移植抗体。迄今为止，已有100多种鼠单抗通过CDR移植得到了人源化。基本原理:抗体重链和轻链的可变区主要由CDR和骨架区(FR)组成。其中可变区的6个CDR是负责识别和结合抗原的区域，它们直接与抗原接触，决定了抗体的特异性。骨架区是可变区以外的其它部分，主要起着支持CDR的作用，而且它们的氨基酸组成和排列相对不易改变，因此，可以将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区，就有可能使人单抗获得鼠单抗一样的抗原特异性，并可以最大限度地降低鼠单抗的异源性，这样就得到了改形抗体。与嵌合抗体相比，改形抗体进一步减少了抗体中鼠源部分的比例，降低了人抗鼠抗体，但仍有抗体可能导致抗独特型抗体的产生且存在一些局限性，例如构建方法相对复杂，操作起来费时费力;抗体的晶体结构以及电脑模拟抗体的微细结构上都有很大的问题;降低免疫原性和保持抗原结合活性方面还有很多问题。理所当然，寻找既能实现人源化又可以保持高的免疫学活性的简单易行方法势在必行。
2.表面氨基酸残基人源化一一镶面抗体
1991年由Padlan提出的与CDR移植完全不同的降低鼠源抗体免疫原性的方法。[9]其理论依据是分析了大量鼠单抗可变区和人单抗可变区氨基酸残基的表面暴露情况，结果发现这些暴露的氨基酸残基位置和数量都非常保守，不因为种属和型别而改变。研究表面，这些暴露的氨基酸残基是鼠源可变区免疫原性的主要来源。将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中与人可变区相应的氨基酸残基改为人源的，就可以使可变区表面人源化，消除了异源性而不影响可变区的整体空问构象。
3.表位印记选择
表位印记选择指的是一种与高效筛选噬菌体抗体库技术相结合的人源化抗体的方法，可以通过数论筛选就能得到完全人源的抗体。基本原理:鼠单抗的一个重链或者轻链可变区基因与人源抗体的重链或者轻链的可变区基因文库配对，得到杂合的人鼠抗体库。借助噬菌体抗体库的高效筛选方法，能迅速得到所需抗体，比CDR移植简单且能得到真正的人抗体。缺点:筛选工作量特别大。 小分子抗体顾名思义是分子量较小的抗体片段，它的抗体分子的抗原结合部位仅仅局限于重链和轻链的可变区。虽然分子很小但它既保持了亲本单抗的亲和力具有亲本单抗一样的特异性。种类主要包括:抗原结合片(Fab)抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体、最小，而且识别单位。
1.Fab抗体
Fab抗体为仅含Fab分子，Fab段由完整的轻链(恒定区CL和可变区VLCL)和重链Fd段(第一恒定区CH1和可变区VH)通过一个二硫键连接形成异二聚体，整个分了大小约占总抗体的三分之一，仅含有一个抗原结合位点。将完整轻链和重链Fd的编码基因进行连接，可在大肠杆菌中表达，形成完整的二硫键和立体折叠，可以保存Fab断的功能。常被用于实验室的研究工具。
2.Fv抗体
Fv抗体仅由轻链和重链的可变区组成通过非共价键连接，是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。该片段由于是通过非共价键连接的，所以稳定性不好，十分容易解离。采用适当的方法来解决Fv片段稳定性问题。
3.单链抗体
单链抗体的问世解决了Fv抗体的稳定性问题。它由适当的寡核普酸序列将轻链和重链可变区连接而成，形成单一链的分子，故称为单链抗体。就是单一肤链的结构大大增加了Fv片段的稳定性。相对完全抗体而言，单链抗体在临床上作为治疗剂有好多优越性。但它也有亲和力下降等缺点。
4.单域抗体
单域抗体仅含重链可变区，结构比Fv的亚单位还小，它是一个具有抗原结合活性的分子。同完整抗体相比，单域抗体仍然具有与抗体结合的同等能力及稳定性。
5.最小识别单位
比单域抗体还小的最小识别单位仅含可变区中单一CDR结构，分了量十分小仅占完全抗体的1%左右，亲和力也相当低，所以被命名为最小识别单位。虽然最小识别单位分了量小、亲和力低，但是它具有与抗原结合的能力。 目前，单克隆抗体技术在食品生产加工以及科学研究中得到广泛的应用，食品基质中的细胞、大分子聚介物的小分子半抗原物质均能通过单克隆技术研究或检出。 如，用单克隆抗体技术快速检测食品中的农兽药。单克隆抗体在乳品工业中主要用于牛奶成分分析，尤其对非正常风味牛奶的微生物与酶的鉴定;牛奶中的病原微生物和毒素的检测;加工工艺对牛奶蛋白结构的影响以及牛奶中掺物的识别。向左转|向右转

各位老师，针对近几年特别火热的单抗药物，我们想推出一条专门针对单抗药物的药用原辅料产品线，希望大家能出出主意，集思广益，多谢了
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