
Dotblotanalysisusingtheantibodydirectedagainst5-caC
Todemonstratethespecificityoftheantibodyagainst5-caC(Cat.#25201),aDotBlotanalysiswasperformedusingsyntheticoligonucleotidescontainingdifferentmodifiedC-bases(indicatedinred).125and25ngoftherespectiveoligoswereboundtoaStreptavindin-coatedmulti-wellplate.Theantibodywasusedatadilutionof1:1,000.ThebindingofantibodytotheDNAwasmeasuredbyECLchemiluminescence.Figure1showsahighspecificityoftheantibodyforthecarboxylatedcytosine.
Immunofluorescenceassayusingtheantibodydirectedagainst5-caC
293TcellsweretransfectedwitheitherthemouseFLAG-taggedwild-typeTet1(Tet1CD)orthecatalyticallyinactiveFLAG-taggedC-terminaldomainofTet1(Tet1mCD)andstainedwiththeantibodyagainst5-caC(Cat.#25201),diluted1:500,andwithananti-FLAGantibody,followedbyDAPIcounterstaining.
Immunoprecipitationusingtheantibodydirectedagainst5-caC
Immunoprecipitationwasperformedwiththeantibodyagainst5-caC(Cat.#25201)on2µgofJ1ESgenomicDNA,spikedwith1pgofacontrolDNAfragment(approximately700bpfromtheRFP(Ringfingerprotein)gene)containingdifferentcytosinemodifications.ThemCandhmCcontrolDNAwasgeneratedbyPCRwiththecorrespondingnucleotide.ThecaCcontrolfragmentwasobtainedbyinvitromethylationusingM.SssImethyltransferasefollowedbyoxidationwithpurifiedTet2.TheimmunoprecipitatedDNAwassubsequentlyanaysedbyqPCRusingprimersspecificforthecontrolDNAfragmentsandforGAPDH,usedasanegativecontrol.Figure3showstheenrichmentcalculatedastheratiooftherecoveryofthecontrolDNAversustherecoveryoftheGAPDHnegativecontrol.
Storeat–80°Cforupto2years.Centrifugeafterfirstthawtomaximizeproductrecovery.Aliquottoavoidrepeatedfreeze/thawcycles.Aliquotsmaybestoredat–20°Cforatleastonemonth.
IF(1:500)
DNAIP(4µggenomicDNA/IP)
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制备抗体都需要进行纯化处理
多抗,稀释度更大,特异性相对较差,容易出现多条带。
兔的单克隆抗体和鼠的单克隆抗体在使用上不会有什么区别。
用来很多抗体,许多时候觉得单抗多抗也未必是理论上那样的。单抗做不好的也有,多抗条带唯一且清晰的也有。
而且很多蛋白的抗体未必有那么多的选择。
1.单克隆抗体的优点:
(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代,只要不发生细胞株的基因突变,就可以不断的生产高特异性、高均一性的抗体.
(2)可以用相对不纯的抗原,获得大量高度特异的、均一的抗体.
(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体,所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,如IRMA和ELISA等.
(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗.
2.单克隆抗体的局限性:
(1)单克隆抗体固定的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围.由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应,所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成.
(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体.
(3)制备技术复杂,而且费时费工,所以单克隆抗体的价格也较高.
说得简单点就是,细胞核是原封不动的,没有重组过,而细胞核外的东西是很多别的细胞中提取出来的并组合起来的。这样的混合体淋巴细胞产生的抗体具有很强的嵌合能力,针对性比一般的抗体强,但是它的来源没变,所以称之为混合单克隆抗体

