【求助】pIRES2EGFP载体表达产物可以用GFP标签抗体做westerblot吗？

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2021-08-03

问题描述：

如题，最近刚刚构建了pIRES2-EGFP重组质粒，暂没加其他标签，要转染MDCK细胞，1500bp，产物大约57kDa，请问表达产物可以用GFP标签抗体做westernblot鉴定吗？

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chutu

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你的载体上有EGFP的启动子吗？如果细胞表达EGFP，那用抗体做组化或western应该可以测到

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chutu你的载体上有EGFP的启动子吗？如果细胞表达EGFP，那用抗体做组化或western应该可以测到应该有，是IRES介导的EGFP共表达，这种情况下，可以用抗GFP抗体来进行westernblot，检测表达的目的蛋白吗？

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chutu

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用GFP的表达代表目的蛋白的表达，楼主是这个意思吗？这种办法还是不可靠啊。因为IRES介导的下游基因表达与先导基因的表达是不对等的，下游基因的表达量只能达到上游基因的20%，所以你检测到GFP表达当然可以表明上游目的基因表达了，但如果GFP检测不到却并不能表明上游目的基因一定没有表达。不是直接的证据呀。

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nogojin

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由于你的目标蛋白没有与GFP融合，这样用GFP抗体是不能检测到你的目标蛋白的。这里的GFP主要用于监测转染的细胞和转染效率的。

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展开引用chutu用GFP的表达代表目的蛋白的表达，楼主是这个意思吗？这种办法还是不可靠啊。因为IRES介导的下游基因表达与先导基因的表达是不对等的，下游基因的表达量只能达到上游基因的20%，所以你检测到GFP表达当然可以表明上游目的基因表达了，但如果GFP检测不到却并不能表明上游目的基因一定没有表达。不是直接的证据呀。......谢谢，我表达的是受体蛋白，大约55kDa，加标签担心影响受体活性，在这种情况下您认为哪种标签较为合适。

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nogojin由于你的目标蛋白没有与GFP融合，这样用GFP抗体是不能检测到你的目标蛋白的。这里的GFP主要用于监测转染的细胞和转染效率的。谢谢，这种情况下，只能使用单抗或者人为的N端加入标签，因为是受体蛋白，大约55kDa，加标签担心遮盖结合位点，您认为哪种标签较为适用？

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nogojin

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我建议：1.作为受体蛋白功能研究这样的设计就可以了。加标签可能会影响受体功能；2.从检测你的目标蛋白表达角度来说，你可以使用你目标分子的抗体进行WB和IF。

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nogojin我建议：1.作为受体蛋白功能研究这样的设计就可以了。加标签可能会影响受体功能；2.从检测你的目标蛋白表达角度来说，你可以使用你目标分子的抗体进行WB和IF。谢谢，感谢，我会寻找一下单抗。