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【求助】pIRES2EGFP载体表达产物可以用GFP标签抗体做westerblot吗?
2021-08-03
问题描述:

如题,最近刚刚构建了pIRES2-EGFP重组质粒,暂没加其他标签,要转染MDCK细胞,1500bp,产物大约57kDa,请问表达产物可以用GFP标签抗体做westernblot鉴定吗?

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chutu
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你的载体上有EGFP的启动子吗?如果细胞表达EGFP,那用抗体做组化或western应该可以测到
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chutu你的载体上有EGFP的启动子吗?如果细胞表达EGFP,那用抗体做组化或western应该可以测到应该有,是IRES介导的EGFP共表达,这种情况下,可以用抗GFP抗体来进行westernblot,检测表达的目的蛋白吗?
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chutu
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用GFP的表达代表目的蛋白的表达,楼主是这个意思吗?这种办法还是不可靠啊。因为IRES介导的下游基因表达与先导基因的表达是不对等的,下游基因的表达量只能达到上游基因的20%,所以你检测到GFP表达当然可以表明上游目的基因表达了,但如果GFP检测不到却并不能表明上游目的基因一定没有表达。不是直接的证据呀。
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nogojin
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由于你的目标蛋白没有与GFP融合,这样用GFP抗体是不能检测到你的目标蛋白的。这里的GFP主要用于监测转染的细胞和转染效率的。
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展开引用chutu用GFP的表达代表目的蛋白的表达,楼主是这个意思吗?这种办法还是不可靠啊。因为IRES介导的下游基因表达与先导基因的表达是不对等的,下游基因的表达量只能达到上游基因的20%,所以你检测到GFP表达当然可以表明上游目的基因表达了,但如果GFP检测不到却并不能表明上游目的基因一定没有表达。不是直接的证据呀。......谢谢,我表达的是受体蛋白,大约55kDa,加标签担心影响受体活性,在这种情况下您认为哪种标签较为合适。
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nogojin由于你的目标蛋白没有与GFP融合,这样用GFP抗体是不能检测到你的目标蛋白的。这里的GFP主要用于监测转染的细胞和转染效率的。谢谢,这种情况下,只能使用单抗或者人为的N端加入标签,因为是受体蛋白,大约55kDa,加标签担心遮盖结合位点,您认为哪种标签较为适用?
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nogojin
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我建议:1.作为受体蛋白功能研究这样的设计就可以了。加标签可能会影响受体功能;2.从检测你的目标蛋白表达角度来说,你可以使用你目标分子的抗体进行WB和IF。
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nogojin我建议:1.作为受体蛋白功能研究这样的设计就可以了。加标签可能会影响受体功能;2.从检测你的目标蛋白表达角度来说,你可以使用你目标分子的抗体进行WB和IF。谢谢,感谢,我会寻找一下单抗。
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