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亲和素―生物素―过氧化物酶复合物法
亲和素―生物素―过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-pcroxidasecomplexmethod,ABC法)的特点是将亲和素作为“桥"与生物素化的抗体和生物素结合的酶连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增加敏感性。由于该法是以物质对某种组织成分具有高度亲和力为基础，一方面区别于古老的组织化学分解、置换、氧化和还原反应，另一方面本质上又是非抗原抗体反应，因此，Bayer(1976年)首次称之为亲和组织化学(affinityhistochemistry)。
1．原理 生物素(biotin)为含硫的杂环单羧酸，分子量小，通过其羧基与蛋白质的氨基结合，从而可标记抗体和酶。亲和素(avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白，在鸡蛋白中被发现，分子量为68000。生物素与亲和素有很高的亲和力，1个亲和素分子上有4个生物素结合位点。在ABC法中，不对特异性第一抗体进行标记，而用生物素标记第二抗体，染色前按一定比例将亲和素与牛物素标记的讨氧化物酶混合，制成ABC合物，并使亲和素分子上至少空出1个生物素结合位点。染色时，标本中的抗原先与第一抗体结合，后者再与生物素标记的第二抗体结合，然后加入ABC复合物，结合到第二抗体的生物素上，最终形成的复合物网络了大量的酶分子。因此，敏感性更高。目前常用的亲和素从链霉菌(streptomyces)培养物中提取，因此称为链霉亲和素―生物素―过氧化物酶复合物技术(streptavidinbiotin-peroxidasecomplexmethod，SABC法)。
免疫组织化学SABC法原理示意图
2．免疫组织化学酶类标记物 作为免疫酶组织化学标记物的酶以共价键的形式结合在抗体上，制成酶标抗体(SABC法是链霉亲和素―生物素与酶结合)，再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，光镜或电镜下进行细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定性和定位研究。从理论上讲。用细胞化学方法能显示的酶均可用于免疫酶组织化学标记物，但实际上能用于免疫组织化学技术的酶并不多。一般来讲，用于标记的酶应具备以下性质：
(1)酶催化的底物必须是特异的，而且容易被显示，即催化反应所形成的产物易于在光镜和电镜下观察；
(2)酶反应形成的终产物必须是稳定的沉淀，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散而影响组织学定位；
(3)较易获得纯的酶分子；
(4)中性pH值时，酶分子应稳定；
(5)在酶标过程中，酶连接在抗体上，不影响两者的活性。
符合上述要求的最为常用的酶是辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)。HRP存在于植物辣根中，由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合成一种糖蛋白．分子量约40kD，稳定性好，其底物为过氧化物和供氢体，前者常用过氧化氢和过氧化氢尿素，后者常用二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)。DAB是无色还原型染料，能被氧化生成不溶于水且不易褪色的棕色氧化性染料。AP是磷酸酯的水解酶，可通过靛蓝四唑反应显色。靛蓝四唑反应底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而硝基蓝四唑(NBT)在氧化过程中被还原成不溶性紫蓝色沉淀。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶在SABC法染色前均可与亲和素―生物素分别制成链霉亲和素―生物素―辣根过氧化物酶复合物(SABC-POD)和链霉亲和素―生物素―碱性磷酸酶复合物(SABC-AP)复合物。
编辑：viviank
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发布于 ： 2019-01-06
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