| 实验材料 | 待测蛋白质样品 试剂、试剂盒 | 过硫酸铵4X凝胶上样缓冲液甲醇PdCl25X反应缓冲液TMPyP三氟乙酸Tris-二吡啶钌 仪器、耗材 | 加热器光交联反应器SepPakC18容器分光光度计注射器滤膜 实验步骤 |
一、用Pd（Ⅱ）金属化TMPyP1.将1mg(1.2umol)的TMPyP溶于1.4ml水中，然后加入0.34mg(1.9umol)的PdCl2,加热至95°C反应2h。
2.冷却样品，并用孔径为45um的注射过滤器过滤，加入TFA至终浓度为1%。 3.将溶液注入用1%TFA平衡好的SepPakC18容器中，用5ml1%的TFA冲洗容器。 4.用0.5ml的甲醇，将TMPyP-PcKII)洗脱到一预先称重的小离心管中。 5.甲醇蒸发后，将TMPyP-Pd(II)溶于1ml水中，在417nm处[e=158X103L/(mol·cm)]测出其浓度。 该试剂可在冷冻避光条件下无限期保存。 二、光交联蛋白质
1.在1.7ml的小离心管内准备总反应体积为20W的蛋白样品，其中含有蛋白质、1X反应缓冲液和125umol/L的TMPyP-Pd(II)，避光反应。 2.在光裂解反应之前，加人5ul新鲜配制的过硫酸铵。确保样品管在样品支架上呈水平状态（即与光束平行）。 3.将SLP相机与光源间的挡板移开，控制快门的开启时间为0.5s，此处可以使用相机的自动计时器。在关上快门后，将相机与光源之间的挡板重新装上。 4.迅速加入7ul4X上样缓冲液，以终止反应。 5.SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色或Western印迹，对反应产物进行分析。 图10.26显示的是一个典型的交联反应实验结果。在这个实验中，用上述方法使UvsY发生交联反应。可以从第六列看到：只有在金属复合物和过硫酸铵均存在的情况下，闪烁曝光光裂解交联反应才得以发生。同时可以看到的是：在第三列上，在未加人过硫酸铵的情况下长期曝光，可发生氧分子介导的交联反应。 |
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