Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术金锄头文库
| 提供商： | 生工生物工程 |
| 服务名称： | 哺乳动物细胞表达系统重组蛋白表达与纯化 |
步骤1.目标基因全基因合成：
1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。
2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优化。
3.合成设计好的基因序列。
交付内容：目的基因（在T载体或常规穿梭载体上）及测序报告。
时间：2-3周
步骤2.：目标基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体
1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。
2.将目标基因亚克隆到真核表达载体上。
3.测序验证构建质粒的准确性。
4.通过中抽获得重组的质粒DNA
交付内容：正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。
时间：2周
步骤3.小量转染并通过Western-blot检测表达：
1.利用转染试剂将重组质粒转入合适的哺乳动物细胞中。
2.从转染后24到72小时，每12小时取样，通过SDS-PAGE和Western-blot检测目标蛋白表达情况。
3.可提供表达细胞株：293，293T，NIH/3T3，COS-7，CHO。
交付内容：目标蛋白表达结果。
时间：2周
说明：
1.如果转染不成功，则不收取费用。如果没有检测到目标蛋白表达，也要收取80%实验费用。
1.如果转染不成功，则不收取费用。如果没有检测到目标蛋白表达，也要收取80%实验费用。
2.每次Western-blot检测最多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或?是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。
步骤4.目标蛋白表达及纯化：
1.培养500ml哺乳动物细胞，然后将重组质粒转染到细胞中，通过瞬时表达产生目标蛋白。
2.收集含有目标蛋白的部分（细胞或培养上清）。
3.通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
4.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
5.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。
交付内容：纯化好的目标蛋白及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的最终蛋白，纯度最高可达90%以上。
时间：3-4周
说明：
1.如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。
1.如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用。
2.如果客户需要详细的纯化工艺，包括详细纯化条件及每步结果，则需要加收100%相应费用
3.因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们最终根据实际情况将给客户提供最少0.1mg，最多2mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。
4.我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液）中蛋白质溶液，并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统，所以我们无法保证最终产品的生物学活性，不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性，我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格，我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30%，而如果样品活性合格，我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。
5.每次Western-blot检测最多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测，如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。
步骤5.目标蛋白的再加工及详细检测：
1.内毒素去除，除菌，冻干等进一步加工。
2.通过HPLC，质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
服务内容：
1：除内毒素，
1：除内毒素，
2：过滤除菌，
3：冻干，
4：HPLC检测，
5：质谱检测，
6：N端测序。
交付内容：加工后的终产品及相关实验和检测报告。
时间：2周
步骤6.筛选稳定高表达细胞株：
2.当细胞长到大约2/3孔时，取培养上清检测表达。
3.挑出高表达的细胞团用于下一轮筛选，并在下一次细胞培养基中提高MTX的浓度。
4.重复加压筛选过程，提高细胞株的表达量直到获得合适的稳定表达株。
5.通过SDS-PAGE电泳检测每步表达结果。
6.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。
交付内容：稳定的高表达细胞株及筛选报告。
时间：6-8周
说明：因为每个重组蛋白的表达量受多种条件影响，我们并不能保证最终稳定株的表达量，但一般只有瞬时表达时表达量的1/10左右。
步骤7.大规模制备：
按照小试工艺放大生产规模，制备客户需要的合格蛋白产品。
交付内容：合格的目标蛋白及服务报告。
时间：协商
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发布于 ： 2021-08-02
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