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白蛋白血浆含量、、溶解度、功能较种蛋白质水肿
(2)血浆血白蛋白运输功能
血浆白蛋白能与体内许难溶性机物机离逆结合形易溶性复合物些物质血液循环运输形式由见白蛋白属于非专性运输蛋白理具重要性与体健康密切相关血白蛋白适用于低蛋白血症防治治疗肝硬化及肾病引起水肿或腹水
(3)血浆白蛋白其理作用
血浆白蛋白含量远比球蛋白亲水作用比球蛋白使血浆白蛋白球蛋白起种胶体保护稳定作用肝脏功能障碍引起白蛋白合足使血浆球蛋白失胶体保护作用稳定性降血浆球蛋白稳定性降严重影响些物质体内代谢、利用引起相应症状外白蛋白体内种重要营养物质白蛋白血浆断进行着代谢更新血浆白蛋白解产氨基酸用于合组织蛋白氧化解供应能量或转变其含氮物质
具性激素或药物与白蛋白结合表现其性视其储存形式由于种结合逆性处于态平衡调节些激素药物代谢具重要意义
白蛋白具黏性、胶质性物质体内遇重金属离自与重金属离结合由排泄系统排体外起解毒作用食用含白蛋白丰富食物避免重金属离吸收毒白蛋白胃壁保护作用
血白蛋白血液制品种俗称命制品、救命药健康血液提炼加工直接静脉注射病体内其主要功能增强免疫力抵抗力市场价300400元瓶临床主要用于失血创伤烧伤等引起休克、脑水肿及肝硬化、肾病引起水肿或腹水等危重病症治疗及低蛋白血症病
参考:1、白蛋白纯化;2、白蛋白纯化;3、白蛋白抗体亲产工艺;4、包括加热处理步骤血清白蛋白制造;5、沉淀物血制取蛋白 肝功能检查检查白蛋白作用根据白蛋白检查结判断某些疾病同龄段白蛋白值相同新白蛋白值范围28~44g/L14岁白蛋白值范围38~54g/L白蛋白值范围35~50g/L60岁白蛋白值范围34~48g/L般情况白蛋白增高主要见于血液浓缩致相性增高严重脱水休克、严重烧伤、烫伤、急性血、慢性肾腺皮质功能减低症白蛋白降低见于肝硬化合并腹水及其肝功能严重损害(急性肝坏死、毒性肝炎等)营养良、慢性消耗性疾病、糖尿病、严重血肾病综合征等白蛋白降低至25g/L易产腹水
1:血白蛋白理基础:
血清白蛋白(HSA)由肝脏合含量丰富功能非糖基化血浆蛋白具备种理功能白蛋白通占血浆蛋白质总含量50%浓度约0.6mmol/LHSA球形蛋白质由585种氨基酸组 (66-69kd)许带电残基(例赖氨酸、冬氨酸没辅基基团或者碳水化合物)少量色氨酸或者甲硫丁氨酸残基X线衍射晶体析显示白蛋白形三级结构HSA溶液椭圆体约67%HSA三级结构由α螺旋组实际蛋白由3应结构域组(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)每含两亚级结构域(AB)每亚级结构域由6α螺旋组两亚级结构通脯氨酸残基提供灵环结构作相移助于结合物质结构域间二硫键连接灵HSA包含35半胱氨酸残基其部形二硫键(共17)构整三级结构(图1)
图1. 白蛋白三级空间结构
2:血白蛋白化特性治疗潜力
白蛋白体理产物其独特三级空间结构使白蛋白拥化特性临床带更获益
a:维持胶体渗透压:
血白蛋白作种胶体效维持着血浆胶体渗透压体血浆白蛋白含量约35-50g/l,约占血浆总蛋白含量60%血浆80%胶体渗透压源自白蛋白产5%白蛋白(百特商品名:Buminate5%/250ml)胶体渗透压着与体相似胶体渗透压等渗白蛋白输入削减组织间液;20%25%白蛋白高渗白蛋白显著削减组织间液
b:物质结合转运:
HAS能结合许内源性外源性化合物与药物、营养物质给予疗效、解毒抗氧化作用密切相关HSA所能结合物质:药物(抗素、止痛药、抗凝药、抗癫痫药、免疫抑制剂等)、脂肪酸、维素D3、氨基酸、酶、胆红素、激素、金属(铜)、氧化氮、花四稀酸代谢物等纠低蛋白血症使临床获益能白蛋白功能关
c:协调血管内皮完整性
Dubniks等鼠试验发现微血管通透性增加情况5%白蛋白着比工胶体更扩容效认白蛋白能血管内壁构完整血管内皮表层血管内皮表层阻止液体外渗重要结构物质
d:保护血细胞调节凝血
白蛋白体血液组部所白蛋白着血细胞保护调节凝血功能肺旁路手术使用白蛋白作预充液组部患者围术期失血显著低于工胶体每100ml肺旁路术预充液添加少于0.0375g白蛋白保护血细胞血板功能Blanloeil等顾析1954-2000与血液稀释相关文献发现输注白蛋白要血液稀释比例超50%凝血削弱作用
e:激炎症反应
证据表明白蛋白巯基基团能基于氧化原状态发炎症细胞调节变化信号Alam等猪休克模型采用同液体进行复苏发现使用白蛋白全血组复苏体内性粒细胞数量与休克前相比并没显著变化其组均现比较明显性粒细胞数增加所使用白蛋白进行液体复苏并激炎症反应减少炎性物质白介素干扰素量释放体造进步伤害
f:器官保护
基于白蛋白引起全身炎症反应所使用白蛋白已经显示休克复苏调节性粒细胞内皮细胞相互作用减轻肺损伤Martin等发现于急性肺损伤患者使用速尿联合白蛋白比仅使用速尿患者24氧合指数脏指数都显著改善白蛋白给药能改善低白蛋白血症重症患者器官功能呼吸、血管枢神经系统白蛋白联合抗素减少肝硬化合并自发性细菌腹膜炎患者肾损坏死亡发率使用MARS(吸附循环系统使用含白蛋白透析液)治疗4,000位患肝机能异或衰竭患者程表明白蛋白提高肾功能血液力疗效并减少脑水肿肝性脑病发
g:其:抗氧化损伤修复等
亚铁血红素认拥通铁氧化原反应特性获促氧化剂特性HSA十效亚铁血红素结合蛋白旦结合白蛋白促氧化剂特性减弱显示抗氧化剂功能于损伤修复能提供氮源进行损伤修复观点受质疑合蛋白质单位氨基酸白蛋白输注需要解氨基酸再合组织修复相应蛋白质程显且经济直接输注氨基酸直接何解释临床观察白蛋白于术伤口愈合带益处者发现白蛋白于修复组织帮助能通加速新陈代谢达
3:白蛋白液体复苏
a:白蛋白作复苏液增加危重症患者死亡率:SAFE 研究vs. Cochrane荟萃析
白蛋白作液体复苏液使用源自20世纪40代二战挽救数命1998Corchrane荟萃析(24研究1419病例)显示使用白蛋白与使用晶体液相比使危重症病死亡风险增加6%.该文章发表引起巨波澜FDA结论发使用白蛋白警告全球白蛋白处量明显减少随达22篇文章发表致反Cochrane研究结论其Wilkes等更随机照研究(55研究3504病例)进行荟萃析显示采用白蛋白进行液体复苏并增加患者死亡率直至2004程碑式SAFE(Saline versus Albumin Fluid Evaluation)研究结发表明确作危重症患者复苏液白蛋白安全增加死亡率结论美FDA撤销白蛋白警告白蛋白处量恢复1998前水平SAFE研究项随即照研究入选病例达6997例研究主要目研究名称,证实白蛋白安全性首要终点重症患者比较等渗白蛋白与理盐水进行液体复苏28治疗期内死亡率该研究设计并未入组患者白蛋白水平设限两组病基线白蛋白水平均值27g/l白蛋白纠低蛋白血症所带能获益该研究体现SAFE亚组析发现于脓毒症患者使用白蛋白更存率于脑外伤病发现使用白蛋白增加死亡率文章认由于该亚组本量少差异能由于机误差产另外脑外伤6月才评价死亡率合适间随文章认白蛋白增加脑外伤患者死亡率结信使用白蛋白整体器官功能28死亡率并没增加
b:白蛋白作液体复苏液理由
l 白蛋白理功能纠低蛋白血症所液体复苏患者同伴低蛋白血症使用白蛋白进行液体复苏举两做
l 白蛋白器官保护作用病休克间越久越能诱发肾功能损害所使用白蛋白进行液体复苏更保护肾脏等诸脏器
l 凝血保护于剂量液体复苏凝血风险避问题使用白蛋白减少凝血功能遭破坏风险
l 白蛋白扩容效白蛋白能参与构完整血管内皮表层所鼠试验观察结论血管通透性增加5%白蛋白3内扩容效都要优于明胶羟乙基淀粉
l 白蛋白半衰期较健康青男性群作放射标记白蛋白解代谢研究结表明半衰期12.7-18.2(平均14.8)特点使白蛋白血管内维持更久另外白蛋白渗漏至组织间液通淋巴管重新血管内造组织间蓄积
c:5%等渗血白蛋白高渗血白蛋白
内市售血白蛋白制剂4%、5%、10%、20%25%几种浓度其5%20%主流产品两种白蛋白由于渗透压同带临床使用差异5%白蛋白等渗血白蛋白引起组织间液向血管内转移5%/250ml等渗白蛋白输入其血浆扩容量约250-500ml间;20%高渗白蛋白显著削弱组织间液更适合水肿病20%/50ml高渗白蛋白输注其血浆扩容量约230ml5%等渗白蛋白导致组织间液向血管内显著液体流所能更稳定体内环境于功能患者减少衰风险发美比起高渗白蛋白等渗白蛋白扩容面更受临床医师欢迎
d:情况使用应该首选血白蛋白作液体复苏液
于伴低蛋白血症液体复苏患者考虑首选血白蛋白根据病/否水肿判断使用高渗/等渗白蛋白
于伴凝血风险,肾损害风险或功能较差液体复苏患者首选5%等渗血白蛋白
4:纠低蛋白血症能降低死亡率及并发症发风险
血清白蛋白水平与危重症病预显著相关性内著名专家黎介寿发现严重染危重病白蛋白水平于35g/l死亡率0;白蛋白水平于20g/l死亡率高达54%
项型荟萃析包括90析低蛋白血症预预测性队列研究 (n=291,433) 9研究纠低蛋白血症治疗前瞻性照试验 (n=535)发现低蛋白血症患者白蛋白水平每降低10g/l其死亡率增加137%并发症发率增加89%ICU停留间延28%住院间延71%治疗费用增加66%文章认低白蛋白血症增加危重患者死亡率并发症独立危险素给予外源性白蛋白需达血浆白蛋白浓度达30g/L显著减少并发症发率79项随机试验荟萃析使用白蛋白与使用晶体、工胶体、使用白蛋白或剂量白蛋白比较随机照试验共4755例患者其59项(占79项74.7%)试验治疗结显著性差异认使用白蛋白带临床获益发现低白蛋白血症患者剂量白蛋白减少死亡率说明同临床领域使用白蛋白带临床获益所于低蛋白血症患者要临床觉使用必要应该限制使用
5:白蛋白产品安全性
白蛋白体产物所其产良反应较各种工胶体低参考白蛋白其胶体液用于扩容安全性比较(表2)白蛋白急性反应事件威胁命严重良事件均少
表2.白蛋白其胶体液用于扩容安全性比较
10家全球主要白蛋白供应商1998-2000总共向市场供应648000000克白蛋白共收198非致命性良事件13致命性良事件报道若40克处剂量析显示:每1000000处非致命性良反应发率4.65,致命性良反应发率0.185结论显示:血白蛋白具非安全记录
6:使用白蛋白经济性
白蛋白减少并发症发率同缩短ICU停留间住院间保护凝血功能等所整疗程价格反更加经济项美研究统计5156名脓毒症患者发现使用白蛋白每命节约6037欧元每每节约617欧元美较医院数据库院数据进行顾性析19,578冠脉搭桥术患者操作应用胶体使用白蛋白组死亡率2.47%,低于非蛋白胶体组3.03%应用白蛋白每命节省52,000-54,000美元图" class="ikqb_img_alink">
1. 血细胞与血清分离:
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm离心20min .弃沉淀,留上清备用(沉淀为血细胞,上部为血清).
2. 乳糜粒分离:4000rpm 10°C离心10分钟,采用密度梯度离心
梯度液配置:离心管下部3/4容积加血浆,上部1/4容积加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮,将乳糜粒吸出,留其余液体备用.
3. 血清蛋白分离:除去球蛋白,白蛋白及其它蛋白质.
5000rpm 10°C离心1h,密度梯度离心
梯度.液配置:管容量1/3为血清,2/3为1.31g/ml,NaCl+NaBr,搅拌后终密度为1.21g/ml .管上部1/6容积为血清脂蛋白,下部5/6为其它蛋白.
4.取2ml下部5/6血清于小试管中,加0.9%氯化钠溶液2.0ml,边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml,加入PBS洗脱液2ml,混匀后于室温中放置10min,此步骤可重复1~2次
3000rpm 离心5min.沉淀物即是ǐ-球蛋白.
二.凝胶层析提纯血清ǐ-球蛋白(1)装柱:海绵垫装入玻璃柱底端,作为柱底支持物,装入定量的蒸馏水(约为柱体积的1/5),以避免胶粒直接冲击柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.将密实洗净的层析柱保持垂直位置,关闭出口,柱内留下约2.0ml洗脱液.边搅拌凝胶,边向柱内缓慢,连续,均匀地加入凝胶,(打开柱底端的螺旋夹)不要中断,使胶粒均匀沉降,以免胶面一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内,打开柱底部出口,调节流速0.3ml/min.凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部倾斜和发生断层;检查装好的凝胶柱用眼观察有无凝胶分层.沟流和气泡现象.最后使凝胶床达20厘米高,床面上保持有洗脱液,操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”.用缓冲液平衡凝胶柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上样与洗脱:小心控制凝胶柱下端活塞,使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面,关紧下端出口,用长滴管吸取盐析法制备的球蛋白混合样品,将装有上样液的滴管头插入床面以上1-2cm处,小心缓慢地贴壁加到凝胶床表面.柱上样量控制在柱体积的2%-5%.打开下端出口,将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内.关闭出口,小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁.打开下端出口,待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液.如此重复三次,以洗净内壁上的样品溶液.然后可加入适量缓冲液开始洗脱.加样开始应立即收集洗脱液.洗脱时接通蠕动泵,流速为0.5ml/min,用部分收集器收集,每管1ml.(3)洗脱液中NH4+与蛋白质的检查:取比色板两个(其中一个为黑色背底),按洗脱液的顺序每管取一滴,分别滴入比色板中,前者加双缩脲2滴,出现蓝色混浊即示有蛋白质析出,由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度;于另一比色板中,加人奈氏试剂l滴,以观察NH4+出现的情况. 合并球蛋白含量高的各管,混匀.除留少量作电泳鉴定外,其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化.三.纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度,并用0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡,然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上,用同一缓冲液洗脱、分管收集.用20%磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况.(装柱、上样、洗脱,收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析).四.浓缩经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ-球蛋白液往往浓度较低.为便于鉴定,常需浓缩.收集较浓的纯化的γ-球蛋白溶液2m1,按每ml加0.2~ 0.25gSephadex G一25干胶,摇动2~3min, 3000r/min 离心5min.上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液.五. 乙酸纤维素薄膜电泳鉴定ǐ-球蛋白(一)仪器与薄膜的准备1.醋酸纤维素薄膜的润洗与选择用竹夹子取一片薄膜,小心地平放在盛有缓冲液的平皿中,若漂浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,则此膜均匀可用于电泳;若薄膜润湿缓慢,色泽深浅不一或有条纹及斑点等,则表示薄膜厚薄不均匀应弃去,以免影响电泳结果.将选好的薄膜用竹子轻压,使其完全浸泡于缓冲液中约30min后,方可用于电泳.
2.电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度,剪裁尺寸合适的滤纸条.在两个电极槽中,各倒入等体积的电极缓冲液,在电泳槽的两个膜支架上,各放两层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液内.当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端能紧贴在膜支架上.滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁,因而称为滤纸桥.
3.电极槽的平衡用平衡装置(或自制平衡管)连接两个电泳槽,使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态,一般需平衡15——20min.注意,取出平衡装置时应将活塞关紧.
(二)点样
1.制备点样模板取一张干净滤纸(10×10cm),在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线,此线为点样标志区.
2.点样用竹夹子取出浸透的薄膜,夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液.无光泽面向上平放在点样模板上,使其底边与模板底边对齐.点样区距阴极端1.5cm处.点样时,先用玻璃棒或血色素吸管取2—3��L血清,均匀涂在加样器上,再将点样器轻轻印在点样区内,使血清完全渗透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线.此步是实验的关键,点样前应在滤纸上反复练习,掌握点样技术后再正式点样.
(三).电泳用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上,要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂.如一电泳槽中同时安放几张薄膜,则薄膜之间应相隔几毫米.盖上电泳槽盖,使薄膜平衡10min.用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接,注意不要接错.在室温下电泳,打开电源开关,用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA(8片薄膜则为4.8mA).通电10—15min后,将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA(8片共8 mA),电泳时间约50—80min.电泳后调节旋扭使电流为零,关闭电泳仪切断电源.
(四).染色与漂洗
1.血清蛋白染色与漂洗脱色用解剖镊子取出电泳后的薄膜,放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中,浸染5min,取出后再用漂洗液浸洗脱色,每隔10min 换漂洗液一次,连续数次,直至背景蓝色脱尽.取出薄膜放在滤纸上,用吹风机的冷风将薄膜吹干.
(五)透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min,立即放入透明乙液中浸泡1min,取出后立即紧贴于干净玻璃板上,两者间不能有气泡,约2—3min薄膜完全透明.若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次,垂直放置待其自然干燥,或用吹风机冷风吹干且无酸味.再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗,当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角,用手轻轻将透明的薄膜取下,用滤纸吸干所有的水分,最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min,再用滤纸吸干液体石蜡,压平.此薄膜透明,区带着色清晰,可用于光吸收计扫描.长期保存不褪色.
(六)结果判断与定量血清蛋白电泳经蛋白染色后,可显示出区带,未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定.可采用洗脱法或光吸收扫描法,测定各蛋白组分相对百分含



