【求助】关于线粒体提蛋白的问题
2021-08-01
问题描述：
我想问一下我提出大鼠脑线粒体后提线粒体蛋白的方法：用常规细胞裂解液【7mmol/L尿素（urea）、2mmol/L硫脲(thiourea)、4％CHAPS、10mmol/L硫苏糖醇（DTT）、pharmalyte（载体两性电介质就是IPG的buffer）pH3-10(1:50稀释)】60－100ul，吹打并振荡使蛋白尽量溶解。12000g离心10min。收集上清即为蛋白质提取物。
这样可不可以？
另还有几个问题：1、这样的裂解液裂解线粒体提蛋白可不可以
2、裂解液加多少剂量
3、12000g离心10min和30分钟有没有区别
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ccy_sna
用户
裂解液和样品的比例是多少
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DIGE
用户提出脑线粒体后，从你裂解液的配方看，你是想做双向电泳吧。上面的配方适合提取线粒体总蛋白，但是要注意几点：1。加入裂解液后，最好在冰浴中静置10-20分钟，使线粒体膜被充分裂解。2。最好在加入裂解液后超声，100W，6s，4次，这样可大大增加线粒体内蛋白的释放。但功率不能太大，否则部分蛋白会降解。3。最好用25000g离心，一般30min-60min内均可。4。加入裂解液的量，决定你最终的样品液浓度。一般200-400ul就行了。当然，你最好制得样品后立刻定量，再根据你2DE的上样量将蛋白分装保存。
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ccy_sna
用户我是提线粒体跑2－D请问是不是次序是这样的：加入裂解液－－然后冰浴10－20分钟－－然后超声－－然后25000g离心，30min-60min。
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DIGE
用户是的。祝实验顺利。
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ccy_sna
用户谢谢DIGE!这星期就要进实验室了，很紧张！总担心做不好！谢谢你得帮助！
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kakeey
用户你好，楼主！我也想买载体两性电解质PH3-10,可是问了几家公司，他们25ml都要三千多元，而且没有分装。我想请问楼主，你们的是那家公司定的，有分装的吗，大概价格多少。谢谢！
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