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Haematologic Technologies/Human Prothrombin Fragment 2/HCP2-0010/1 mg
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Haematologic Technologies/Human Prothrombin Fragment 2/HCP2-0010/1 mg
品牌 / 
HTI
货号 / 
HCP2-0010
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4000-520-616
Formulation50%glycerol/water(v/v)
Storage-20°C
Purity>95%bySDS-PAGE
ActivityDeterminationN/A
ShelfLife(properlystored)12months
DomainStructureofProthrombin
Thedomainstructureofprothrombinisrepresented,where:GLA=regioncontainingγ-carboxyglutamicacidresidues,KRINGLE=regionsofinternalsequencehomology,CATALYTICDOMAIN=regioncontainingtheserineproteasecatalytictriad.ArrowsindicatethesiteswhichareproteolyticallycleavedbyfactorXaduringactivationofthezymogen.

SampleGelInformation:

GelNovex4-12%Bis-Tris
Load1µgperlane;purifiedhumanprothrombin
BufferMOPS
StandardSeeBluePlus2;Myosin(191kDa),PhosphorylaseB(97kDa),BSA(64kDa),GlutamicDehydrogenase(51kDa),AlcoholDehydrogenase(39kDa),CarbonicAnhydrase(28kDa),MyoglobinRed(19kDa),Lysozyme(14kDa)

Overview:

ProthrombinisavitaminK-dependentplasmaproteinwhichissynthesizedintheliver(1).Priortosecretionintoplasma,prothrombinundergoespost-translationalmodificationbyavitaminK-dependentcarboxylasewhichconvertstenspecificglutamicacidresiduestoγ-carboxyglutamicacid(gla).Thetenglaresiduesarelocatedwithinthefirst40aminoacidsofthematureproteinandcontributetotheABIlityofprothrombintobindtonegativelychargedphospholipidmembranes.Prothrombincontainstworegionsofinternalhomologywhicharereferredtoas"kringle"structures.Theseregionsofconspicuoussecondarystructurearelocatedbetweenresidues40and270ofthematureplasmaproteinandreplacethegrowthfactordomainsfoundinseveralotherplasmaserineproteases.Thusfar,nofunctionhasbeenascribedtotheseregions,butthereissUSPicionthattheymayplayaroleinoneofseveralbinaryproteininteractionsinvolvingprothrombin.Thematuresinglechainproteincirculatesinplasmaasazymogenand,duringcoagulation,isproteolyticallyactivatedtothepotentserineproteaseα-thrombin.Thisproteolysisiscatalyzedbytheprothrombinaseenzymecomplex.Duringactivation,prothrombiniscleavedatArg271-Thr272(human)/Arg273-Thr274(bovine)andatArg320-Ser321(human)/Arg323-Ser324(bovine)toa"pro"fragment(fragment1.2)andthrombin,thelatterofwhichiscomposedoftwochainscovalentlylinkedbyadisulfidebond.Inthecaseofhumanprothrombin/thrombin,thereisanadditionalthrombinfeed-backcleavageatArg284-Thr285resultinginanadditional13aminoacidsbeingremovedfromthematurethrombin“A”chain.

HumanprothrombinispreparedfromfreshfrozenhumanplasmaasdescribedbyBajajandcoworkers(2).BovineprothrombinispreparedfromfreshbovineplasmausingamodificationoftheproceduredescribedbyOwenandcoworkers(3).Purifiedprothrombinissuppliedin50%(vol/vol)glycerol/H2Oandshouldbestoredat-20oC.PurityisdeterminedbySDS-PAGEanalysis,andactivityismeasuredbyclottingand/orchromogenicsubstrateassay,followingconversionofprothrombintothrombin.

Properties:

LocalizationPlasma
Plasmaconcentration100µg/ml(1)
Molecularweight72,000(1,4,5).
Fragments:
ProthrombinFragment1-21,700
ProthrombinFragment2-12,866
ProthrombinFragment1.2-34,566
PrethrombinFragement1-49,900
PrethrombinFragment2-37,580
Extinctioncoefficient
E
1%
1cm,280nm
13.8(human)(4)
14.4(bovine)(1)
Isoelectricpoint4.7-4.9(human)(6)
4.4-4.9(bovine)(6)
Structuresinglechain,NH2-terminalgladomain,twokringleregions
Percentcarbohydrate8.2%(human)(4)
10.0%(bovine)(5)
Post-translationalmodificationstenglaresidues(4,5)
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EDTA和Tris的混合液,配方:Tris-Cl (pH7.4) 20mM,EDTA 1mM.可加入蛋白酶抑制剂,提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM)。⑴ 匀浆 对于组织,可每50~100mg加1ml裂解液,肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温,快速匀浆 查看更多>
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2018-06-17
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Home-made Taq Polymerase PurificationI also have the bacteria containing the clone. It appears to produce lots of Taq and is quite stable.The proceedure takes 查看更多>
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细胞癌变后,细胞膜表面的糖蛋白会减少。甲胎蛋白是一种,糖蛋白。这种长蛋白主要来自于胎儿的干细胞,常人体内极少,而且甲胎蛋白一般是用来检测肝癌的。 当肝细胞发生癌变时,恢复了产生这种蛋白质的功能,而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加,甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标,所以要如果说细胞癌变后,产生甲胎蛋白并不是非常的严谨。因为它只是作为肝癌的一个指标罢了。而抗原的表示范围比较大。所以这里是使用的抗原而不是甲胎蛋白。
蛋白提取时使用蛋白裂解液将细胞裂解,然后离心分为上清液和下层沉淀,如果你说的是这个上清液的话,那么这个上清液是细胞中的可溶性蛋白,一般包括细胞质的蛋白和细胞核的可溶性蛋白,下层沉淀主要是细胞碎片以及不可溶的蛋白以及染色质之类的。
一、细胞裂解的准备
(1)1×107细胞重悬,其来源可为新鲜样品或贮存于-80℃1mol冰冻清洗缓冲液
的无DMSO的样品,冰冻缓冲液包括10mMHEPES(pH7.5),1.5mMMgCl2,10mMKCl,
1mM二硫苏糖醇(DTT),然后离心(16000rpm、4℃、1min)。
(2)重悬细胞团于100ul冰冻裂解缓冲液,其包含10mMTris-HCl(pH7.5),1mMMgCl2,1mMEGTA,0.1mM苯甲基磺酰氟(DMSF),5mMB2巯基乙醇,0.5%CHAPs(Pierce)和10%甘油。
(3)冰育30分,然后在超速离心机中离心30分钟。
(4)去上清,液氮速冻沉淀,裂解细胞于-80℃保存。
二、扩增
(1)在微量管中冻干0.1ug荧光标记的cx反转引物,蜡封(5′CCCTTACCCTTACCC
TTACCCTTA3′)。
(2)于蜡界之上加50ulTRAP反应物,包括Tris-Cl(pH8.3)20mM,1.5mMMgCl2,
63mMKCl,0.005%,TWeen20,1mMEGTA,50mM三磷酸脱氧核苷,0.1ug荧光标记
TS前导引物(5′AATCCGTCGAGCAGAGTT3′),1ugT4基因32蛋白,牛血清白蛋白0.1mg/ml,2UTaqNDA聚合酶(Takara,shyzou)和5ugCHAPs细胞提取液。荧光标记TS引物可由市场购得。扩增前5ug提取物与1ugRNA酶37℃水浴20分钟,为了端粒酶活性的标准化,运用体内端粒酶活性标准(TTAS):TS重叠引物和CX重叠引物(TS:5′AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTC3′及CX:5′CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTATAGGCGCTCAATGTA3′)TS(18bp)和CX(24bp)序列为普通型,下划线标出的为成肌素序列(每个15bp)。成肌素CDNA通过这些引物扩
增产生了150bp的产物,它可用与ITAS扩增端粒酶梯度相同的TS引物和CX引物进行
再扩增。每一项测定用25attogram以显现I-TAS,它并不干扰TRAP测量。
(3)置于22℃10分钟,作为TS引物由端粒酶介导的延伸。90℃热灭活反应物90秒。
(4)PCR扩增,条件94℃30S,50℃30S,72℃1.5min;共27循环。
三、分析
(1)制备8%的变性胶(longRanger,ATBiochem)含6M尿素。
(2)加电泳缓冲液(1×TBE)于电泳槽。
(3)上样缓冲液与产物各1ul混合后上样,上样缓冲液含90%甲酰胺和10%蓝葡聚
糖(Bluedertian)。
(4)95℃预发性4分钟,速冷,上样,运用100bp,150bp,200bp大小荧光标记物。
(5)测序
(6)测序结果由FiagmuntManager程序自动分析,每一荧光峰根据大小、高度、面积定
量。因为过量扩增的产物会产生不可信的面积值,一部分PCR产物应在蒸馏水稀释后再分析
蛋白在细胞内,需要把细胞裂解才能提出
裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解.化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法,通常会很少使DNA 断裂.这两种方法(包括SDS 和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法.机械裂解可以更均一的裂解细胞,同化学裂解相比,机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性.机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞,但也会造成DNA 的断裂.
一、机械裂解法主要有以下两中:
1.热休克(Thermal shock),既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成(freezing and thawing),.原理:由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎.冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率.
2.超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎.但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性.bead-beating 也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小.
二、 化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)
主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种:(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白变性使其稳定;(4)抑制蛋白酶活性.
主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中.在提取RNA或DNA时,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的核酸;如果我们的目的是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白等.以下是细胞裂解中常用试剂和其作用:
50 mM Tris-HCl pH 7.4(缓冲体系),150 mM NaCl(等渗体系),1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDTA(变性剂和稳定剂),5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂),5 μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂),1% Triton x-100(破坏细胞),1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂).7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等.
各位大虾,我想请教下,本人试验作香烟烟雾提取物(CSE)对细胞色素C氧化酶(COX)活性的影响,采用ECV304,拟将细胞破碎后用碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,用GENMED细胞/组织悬液细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒测定COX活性,但是我不知该选用和种方法裂解细胞,请各位多多指导,小妹万分感谢,
不知单纯使用冰浴中超声裂解够了吗?还是说要选用裂解液呢?最主要的就是我不知道该怎么赔这个裂解液,使其COX活性不产生影响
从细胞中提取RNA的方法123
陌语哲俀2021-07-22
操作步骤:
样品处理:
a. 植物组织:取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨,把粉末加入到1ml裂解液中混匀。
b. 动物组织:取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液,用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
c. 贴壁细胞:直接在培养板中加入裂解液裂解细胞,每106细胞加1ml 裂解液。用取样器吹打混匀。
d. 细胞悬液:离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。
e. 血液处理:取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10分钟,10000rpm离心1分钟。弃上清,若沉淀含有红细胞,可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。
将处理后的样品在室温放置5分钟,使得核酸蛋白复合物完全分离。
向匀浆样品中加0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15秒,室温放置3-5分钟。
2-8℃ 12000 rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中,把水相转移到新管中,不要吸到沉淀。
吸附柱前处理:在吸附柱中加入500ul 洗柱液,室温放置2分钟,2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。6. 第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀,加入吸附柱静置2分钟,2-8℃ 12000rpm离心2min,弃废液。7. 向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。8. 向吸附柱中加入600ul漂洗液,2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。9. 12000rpm离心2min,弃掉收集管,将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。10. 将吸附柱放入新管中,向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O,室温放置5min,12000rpm室温离心2min即得到RNA。

注意事项:
所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品,操作过程要小心,带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。
RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯,需电泳检测。
用SDS裂解,RNA酶降解,在过柱,后洗脱
如果要培养,用淋巴细胞分离液。如果只是用于检测,用红细胞裂解液
可以用温和的红细胞裂解液,和外周血一样,裂解液不会对单个核细胞有影响,HY StemCell是一家为干细胞研究服务的知名公司,有各种生化试剂供客户选择,可以查询各大品牌红细胞裂解液,供参考
裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解.化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法,通常会很少使DNA 断裂.这两种方法(包括SDS 和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法.机械裂解可以更均一的裂解细胞,同化学裂解相比,机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性.机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞,但也会造成DNA 的断裂.
一、机械裂解法主要有以下两中:
1.热休克(Thermal shock),既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成(freezing and thawing),.原理:由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎.冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率.
2.超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎.但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性.bead-beating 也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小.
二、 化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)
主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种:(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白变性使其稳定;(4)抑制蛋白酶活性.
主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中.在提取RNA或DNA时,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的核酸;如果我们的目的是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白等.以下是细胞裂解中常用试剂和其作用:
50 mM Tris-HCl pH 7.4(缓冲体系),150 mM NaCl(等渗体系),1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDTA(变性剂和稳定剂),5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂),5 μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂),1% Triton x-100(破坏细胞),1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂).7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等.
ripa裂解液对核蛋白的提取好点。加到细胞培养皿里面,摇15分钟,然后刮下来吸出来,是做western的话加Loading buffer 再95°煮10分钟。
  裂解液裂解是一种比较温和的红细胞去除方法,主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化,淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞,可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。