| Formulation | Hepesbufferedsaline |
| Storage | -80°C |
| Purity | >95%bySDS-PAGE |
| ActivityDetermination | Clottingassay |
| ShelfLife(properlystored) | 12months |
Thedomainstructureofprothrombinisrepresented,where:GLA=regioncontainingγ-carboxyglutamicacidresidues,KRINGLE=regionsofinternalsequencehomology,CATALYTICDOMAIN=regioncontainingtheserineproteasecatalytictriad.ArrowsindicatethesiteswhichareproteolyticallycleavedbyfactorXaduringactivationofthezymogen.
SampleGelInformation:
| Gel | Novex4-12%Bis-Tris |
|---|---|
| Load | 1µgperlane;purifiedhumanprothrombin |
| Buffer | MOPS |
| Standard | SeeBluePlus2;Myosin(191kDa),PhosphorylaseB(97kDa),BSA(64kDa),GlutamicDehydrogenase(51kDa),AlcoholDehydrogenase(39kDa),CarbonicAnhydrase(28kDa),MyoglobinRed(19kDa),Lysozyme(14kDa) |
Overview:
ProthrombinisavitaminK-dependentplasmaproteinwhichissynthesizedintheliver(1).Priortosecretionintoplasma,prothrombinundergoespost-translationalmodificationbyavitaminK-dependentcarboxylasewhichconvertstenspecificglutamicacidresiduestoγ-carboxyglutamicacid(gla).Thetenglaresiduesarelocatedwithinthefirst40aminoacidsofthematureproteinandcontributetotheABIlityofprothrombintobindtonegativelychargedphospholipidmembranes.Prothrombincontainstworegionsofinternalhomologywhicharereferredtoas"kringle"structures.Theseregionsofconspicuoussecondarystructurearelocatedbetweenresidues40and270ofthematureplasmaproteinandreplacethegrowthfactordomainsfoundinseveralotherplasmaserineproteases.Thusfar,nofunctionhasbeenascribedtotheseregions,butthereissUSPicionthattheymayplayaroleinoneofseveralbinaryproteininteractionsinvolvingprothrombin.Thematuresinglechainproteincirculatesinplasmaasazymogenand,duringcoagulation,isproteolyticallyactivatedtothepotentserineproteaseα-thrombin.Thisproteolysisiscatalyzedbytheprothrombinaseenzymecomplex.Duringactivation,prothrombiniscleavedatArg271-Thr272(human)/Arg273-Thr274(bovine)andatArg320-Ser321(human)/Arg323-Ser324(bovine)toa"pro"fragment(fragment1.2)andthrombin,thelatterofwhichiscomposedoftwochainscovalentlylinkedbyadisulfidebond.Inthecaseofhumanprothrombin/thrombin,thereisanadditionalthrombinfeed-backcleavageatArg284-Thr285resultinginanadditional13aminoacidsbeingremovedfromthematurethrombin“A”chain.
HumanprothrombinispreparedfromfreshfrozenhumanplasmaasdescribedbyBajajandcoworkers(2).BovineprothrombinispreparedfromfreshbovineplasmausingamodificationoftheproceduredescribedbyOwenandcoworkers(3).Purifiedprothrombinissuppliedin50%(vol/vol)glycerol/H2Oandshouldbestoredat-20oC.PurityisdeterminedbySDS-PAGEanalysis,andactivityismeasuredbyclottingand/orchromogenicsubstrateassay,followingconversionofprothrombintothrombin.
Properties:
| Localization | Plasma | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Plasmaconcentration | 100µg/ml(1) | |||||||
| Molecularweight | 72,000(1,4,5). Fragments: ProthrombinFragment1-21,700 ProthrombinFragment2-12,866 ProthrombinFragment1.2-34,566 PrethrombinFragement1-49,900 PrethrombinFragment2-37,580 | |||||||
| Extinctioncoefficient |
| |||||||
| Isoelectricpoint | 4.7-4.9(human)(6) 4.4-4.9(bovine)(6) | |||||||
| Structure | singlechain,NH2-terminalgladomain,twokringleregions | |||||||
| Percentcarbohydrate | 8.2%(human)(4) 10.0%(bovine)(5) | |||||||
| Post-translationalmodifications | tenglaresidues(4,5) |
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(1)1×107细胞重悬,其来源可为新鲜样品或贮存于-80℃1mol冰冻清洗缓冲液中
的无DMSO的样品,冰冻缓冲液包括10mMHEPES(pH7.5),1.5mMMgCl2,10mMKCl,
1mM二硫苏糖醇(DTT),然后离心(16000rpm、4℃、1min)。
(2)重悬细胞团于100ul冰冻裂解缓冲液,其包含10mMTris-HCl(pH7.5),1mMMgCl2,1mMEGTA,0.1mM苯甲基磺酰氟(DMSF),5mMB2巯基乙醇,0.5%CHAPs(Pierce)和10%甘油。
(3)冰育30分,然后在超速离心机中离心30分钟。
(4)去上清,液氮速冻沉淀,裂解细胞于-80℃保存。
二、扩增
(1)在微量管中冻干0.1ug荧光标记的cx反转引物,蜡封(5′CCCTTACCCTTACCC
TTACCCTTA3′)。
(2)于蜡界之上加50ulTRAP反应物,包括Tris-Cl(pH8.3)20mM,1.5mMMgCl2,
63mMKCl,0.005%,TWeen20,1mMEGTA,50mM三磷酸脱氧核苷,0.1ug荧光标记
TS前导引物(5′AATCCGTCGAGCAGAGTT3′),1ugT4基因32蛋白,牛血清白蛋白0.1mg/ml,2UTaqNDA聚合酶(Takara,shyzou)和5ugCHAPs细胞提取液。荧光标记TS引物可由市场购得。扩增前5ug提取物与1ugRNA酶37℃水浴20分钟,为了端粒酶活性的标准化,运用体内端粒酶活性标准(TTAS):TS重叠引物和CX重叠引物(TS:5′AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTC3′及CX:5′CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTATAGGCGCTCAATGTA3′)TS(18bp)和CX(24bp)序列为普通型,下划线标出的为成肌素序列(每个15bp)。成肌素CDNA通过这些引物扩
增产生了150bp的产物,它可用与ITAS扩增端粒酶梯度相同的TS引物和CX引物进行
再扩增。每一项测定用25attogram以显现I-TAS,它并不干扰TRAP测量。
(3)置于22℃10分钟,作为TS引物由端粒酶介导的延伸。90℃热灭活反应物90秒。
(4)PCR扩增,条件94℃30S,50℃30S,72℃1.5min;共27循环。
三、分析
(1)制备8%的变性胶(longRanger,ATBiochem)含6M尿素。
(2)加电泳缓冲液(1×TBE)于电泳槽。
(3)上样缓冲液与产物各1ul混合后上样,上样缓冲液含90%甲酰胺和10%蓝葡聚
糖(Bluedertian)。
(4)95℃预发性4分钟,速冷,上样,运用100bp,150bp,200bp大小荧光标记物。
(5)测序
(6)测序结果由FiagmuntManager程序自动分析,每一荧光峰根据大小、高度、面积定
量。因为过量扩增的产物会产生不可信的面积值,一部分PCR产物应在蒸馏水稀释后再分析
裂解液裂解是一种比较温和的红细胞去除方法,主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞，可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。
我的邮箱：maoyuanqing@citiz.net
【2】加入裂解液后可以加用超声破碎细胞。
【3】提完细胞的器具可以在显微镜下看一下，剩余的细胞还多不多。如果还多，说明细胞提取的不彻底，还要改进方法，争取提取的细胞彻底一些。
（仅供参考）
A.优点：
多重分析——一次分析可以检测16种干细胞相关的TF
定量比较——二个样本的差异可以定量分析和比较
步骤简单——探针温育、柱分离、板杂交和HRP检测
无需贵重仪器——无需如Luminex那样的贵重仪器
B.原理：
干细胞转录因子活性多重检测阵列试剂用于同时检测多种TF活性。该技术中，基于TFDNA结合位点的一致性序列，制备一系列生物素标记的探针。当探针混合物与核提取物一起温育时，每个探针寻找相应的TF，形成TF/探针复合物，通过柱离心纯化可以很容易与游离探针分开。结合的探针从混合物中分离出来，通过板杂交分析。板孔中预包被上与探针互补的特异序列，捕获的DNA探针进一步用链酶亲和素-HRP检测，化学发光检测仪测定发光强度（RLUs）。
