Formulation | 50%glycerol/water(v/v) |
Storage | -20°C |
Purity | >95%bySDS-PAGE |
ActivityDetermination | Fibrinogenclottingorchromogenicassay |
ShelfLife(properlystored) | 12months |
Theserineproteaseα-thrombinisproducedbyproteolyticactivationofthezymogen,prothrombin.Theenzymecomplex,prothrombinase,catalyzestheproteolysisoftwopeptidebondsinprothrombin,whichgivesrisetoanNH2-terminalderivedF1.2regionandtheheterodimer,α-thrombin.Alpha-thrombiniscomposedofan"A"chain(Mr=6000)whichiscovalentlylinkedtoa"B"chain(Mr=31,000)throughasingledisulfidebond.
SampleGelInformation:
Gel | Novex4-12%Bis-Tris |
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Load | HumanBeta&GammaThrombin,1µgperlane |
Buffer | MES |
Standard | SeeBluePlus2;Myosin(188kDa),PhosphorylaseB(98kDa),BSA(62kDa),GlutamicDehydrogenase(49kDa),AlcoholDehydrogenase(38kDa),CarbonicAnhydrase(28kDa),MyoglobinRed(17kDa),Lysozyme(14kDa),Aprotinin(6kDa),Insulin,Bchain(3kDa). |
Overview:
Alpha-thrombinisahighlyspecificserineproteasegeneratedbyproteolyticactivationofthezymogenprothrombin(1).Duringcoagulation,thrombincleavesfibrinogentoformfibrin,leADIngtotheultimatestepincoagulation,theformationofafibrinclot.ThrombinisalsoresponsIBLeforfeedbackactivationoftheprocofactorsfactorVandfactorVIII.ThrombinhasalsobeenreportedtoactivatefactorXIIIandplatelets,andalsofunctionsasavasoconstrictorprotein.Theprocoagulantactivityofthrombinisarrestedintwoways:1)inhibitionbyeitherheparincofactorIIortheantithrombinIII/heparincomplex;or2)complexformationwiththrombomodulin.Formationofthethrombin/thrombomodulincomplexresultsintheinABIlityofthrombintocleavefibrinogenandactivatefactorsVandVIII,butincreasestheefficiencyofthrombinforactivationoftheanticoagulant,proteinC.
ThrombinisatwochainenzymecomposedofanNH2-terminal"A"chain(Mr=6,000)andaCOOH-terminal"B"chain(Mr=31,000)whichremaincovalentlyassociatedthroughasingledisulfidebond.Humanthrombinis13aminoacidsshorterthanthebovinethrombinduetoathrombincleavagesiteonthehumanproteinthatisnotpresentinthebovineprotein.
Thrombinisalsoutilizedforsitespecificcleavageoffusionproteinsexpressedinbacteria(9-11).Athrombinsensitivesiteisincorporatedbetweentherecombinantproteinofinterestandpeptidesorproteinswhichfacilitatepurificationand/orexpression.Thetargetproteinisreleasedfromtheexpressedhybridbycleavagewiththrombin.Thrombincanthenbeeasilyremovedbyaffinitychromatography.
Human,bovineandmousethrombinarepreparedfrompurifiedprothrombinusingamodificationoftheLundbladprocedure(1)asdescribedbyNesheimetal.(2).Thrombinissuppliedin50%(vol/vol)glycerol/H2Oandshouldbestoredat-20oC.PurityisdeterminedbySDS-PAGEanalysisandactivityismeasuredinathrombinspecificclottingassay,andcomparedtostandardizedNIHthrombin.ThrombinisalsoavailablewiththeactivesiteblockedwitheitherDFP,FPRck,orbiotinlyatedFPRck.
CleavageofFusionProteins
Inadditiontoitsbroadapplicationincoagulationresearchthrombincanbeusedforsitespecificcleavageoffusionproteins.Athrombinsensitivesiteisincorporatedbetweentherecombinantproteinofinterestandpeptidesorproteinswhichfacilitatepurificationand/orexpression.Thetargetproteinisreleasedfromtheexpressedhybridbycleavagewiththrombin.Thrombincanthenbeeasilyremovedbyaffinitychromatography.Lottolotconsistencyensuresreproducibleresultseverytime.Forexperimentsinvolvingcellcultures,pleasecontactustodiscusscustom,lowendotoxinlotsdesignatedforcellcultureuse.
Properties:
Localization | Plasma | |||||||
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Modeofaction | Serineproteasewhichcleavesfibrinogentoformfibrin;alsoresponsibleforactivationofproteinC,plateletactivationandfeedbackactivationoftheprocofactors,factorVandfactorVIII | |||||||
Molecularweigh | 36,700(3-6) | |||||||
Extinctioncoefficient |
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SpecificActivity | approximately3800NIHunits/mg | |||||||
Isoelectricpoint | 7.0-7.6(human)(3) | |||||||
Structure | twosubunits,approximatelyMr=6,000and31,000 | |||||||
Percentcarbohydrate | approximately5% |
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用SDS裂解,RNA酶降解,
在过柱,后洗脱
不知单纯使用冰浴中超声裂解够了吗?还是说要选用裂解液呢?最主要的就是我不知道该怎么赔这个裂解液,使其COX活性不产生影响
【2】加入裂解液后可以加用超声破碎细胞。
【3】提完细胞的器具可以在显微镜下看一下,剩余的细胞还多不多。如果还多,说明细胞提取的不彻底,还要改进方法,争取提取的细胞彻底一些。
(仅供参考)
一、机械裂解法主要有以下两中:
1.热休克(Thermal shock),既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成(freezing and thawing),.原理:由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎.冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率.
2.超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎.但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性.bead-beating 也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好 虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小.
二、 化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)
主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种:(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白变性使其稳定;(4)抑制蛋白酶活性.
主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同,主要有提取核酸和蛋白两中.在提取RNA或DNA时,我们主要是要充分裂解细胞,得到更多的核酸;如果我们的目的是蛋白,那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液,在提取蛋白后,再根据实验需要复性蛋白等.以下是细胞裂解中常用试剂和其作用:
50 mM Tris-HCl pH 7.4(缓冲体系),150 mM NaCl(等渗体系),1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDTA(变性剂和稳定剂),5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂),5 μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂),1% Triton x-100(破坏细胞),1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂).7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等.
1细胞用冷PBS洗两遍,离心,去除上清;
2加50~100ul三去污细胞裂解液;
3加PMSF,AP各1ul;
4用100ulTIp头吹打数次;
5置冰上15分钟
612000rpm,15min,4度
7取上清。这时,上清呈黏液状,用枪头吸时会将细胞碎片一起吸出。拉丝度很长,测蛋白浓度显示有,各位,这是怎么回事?做WB会影响结果吗?这种蛋白质在保存过程中会容易降解吗?
有的资料上显示第四步,不是用Tip头吹打,而是将EP管在桌上猛敲击几下,这个方法我也试过,但是结果蛋白浓度很低,没有出现上述现象,这是怎么回事呀?
裂解液裂解是一种比较温和的红细胞去除方法,主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化,淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞,可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。
这样可不可以?
另还有几个问题:1、这样的裂解液裂解线粒体提蛋白可不可以
2、裂解液加多少剂量
3、12000g离心10min和30分钟有没有区别
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