重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量

按Qiagen公司的操作手册进行，具体步骤如下。

一、重组蛋白质的诱导表达

1.挑取转化有质粒的单菌落，接种于3ml选择性LB液体培养基中，37^oC，250rpm/min振摇培养过夜。

2.次日将培养过夜的菌液500μl再接种于10ml（1:20）选择性LB液体培养基中，37^oC，250rpm/min振摇培养至光密度（OD₆₀₀=0.6）时，取1ml样本作为诱导前标本，10000g离心1min收集菌体沉淀，－20^oC冻存备用。

3.加入1mol/LIPTG于菌液中，使IPTG终浓度为1mM，37^oC，250rpm/min振摇培养4～5小时。取1ml样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，－20^oC冻存备用。

4.将诱导前后菌体沉淀用20~40μlPBS（pH=8.0）重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热5min，SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果。

5.选取诱导成功的细菌克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于－20^oC保存，准备做下一步分析及纯化。

二、重组蛋白质的分离纯化

重组蛋白质的可溶性鉴定

1.将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液1(Lysisbufferundernativeconditions)中，然后在－80^oC低温冰箱中放置10min。

2.冰中解冻。

3.在冰浴上用超声破碎仪破菌6次，每次10sec，间歇10sec，电压200-300V。

4.10000g，4^oC，离心20min，取上清（为溶液A），－20^oC保存；另将沉淀用同样裂解液1溶解（为溶液B），同样－20^oC保存，供后继分析使用。

5.将上述A、B溶液和诱导前后的细菌进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于A溶液中，则为可溶性蛋白；如果是在B溶液中，则为非可溶蛋白。

重组蛋白质为非可溶性蛋白（变性条件下）的分离纯化

1.将菌体沉淀溶于适量裂解液2（Lysisbufferunderdenaturingconditions）中，室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。

2.10000g，4^oC，离心30min，收集上清液。

3.将Ni-NTAAgarose充填柱子，并连接于Pharmarcia低压液相层析系统，用5倍柱体积的裂解液2平衡Ni-NTAAgarose，调节A₂₈₀值至零线。

4.将适量上清液上样到Ni-NTAAgarose柱子中，并用lysisbuffer冲洗至A₂₈₀值低于0.01。

5.分别用5～10倍柱体积的清洗液1和清洗液2（Washbuffer1and2）清洗柱子，直至A₂₈₀值低于0.01。

6.用洗脱液（Elutionbuffer）洗脱重组蛋白质，在A₂₈₀值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。

三、重组蛋白质的复性、冻干和定量

纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用0.01×PBS透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用Bio-Rad公司蛋白质定量试剂(proteinassay)比色测定蛋白质的含量。